克隆猪主要组织相容性复合体Ⅱ类DR基因座α链和β链及其体外复合体的构建

为推动猪主要组织相容性复合体(MHC)空间构象的研究,体外构建了猪的MHC-Ⅱ类蛋白复合体(SLA-Ⅱ)。首先克隆长白-达兰杂交商品猪DRA和DRB基因,用富含甘氨酸-丝氨酸的Linker(G4S)3连接DRA和DRB的胞外区,用SOE-PCR得到复合体基因DRA-linker-DRB,插入原核表达载体进行表达;对表达的融合蛋白进行Western-blot鉴定、纯化、蛋白酶切割并对切割后的蛋白进行分离和纯化。对分离的目的蛋白、融合蛋白及麦芽糖结合蛋白(MBP)进行二级结构测定。得到83.4 ku的可溶性融合蛋白MBP-DRA-(G4S)3-DRB,其Western杂交带与表达条带大小一致。切割分离后的目的蛋白大小为40.9 ku。目的蛋白DRA-(G4S)3-DRB二级图谱显示该蛋白呈典型α-螺旋结构,各二级结构元件α螺旋、β折叠、转角和随机卷曲的氨基酸数目分别为80、121、101和80,融合蛋白MBP-DRA-(G4S)3-DR与目的蛋白DRA-(G4S)3-DRB的二级结构各元件的符合率分别达到了95%、96.7%、91.1%和93.0%。结果分析表明得到的复合体构象正确,可用于进一步的B细胞抗原表位的筛选等结构和功能研究。     

H5N1亚型禽流感病毒核衣壳蛋白(NP)基因的进化及原核表达

参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Western-Blot鉴定及免疫原性分析。结果表明,克隆的NP基因与GenBank上发表的另外2个河南AIV毒株亲缘关系较近,诱导表达的NP重组蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为70 kDa,并且能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

T-2毒素完全抗原制备及免疫学检测方法的建立

为建立小分子霉菌毒素中T-2毒素残留的检测方法,合成并鉴定T-2毒素完全抗原,通过制备敏感性强的抗T-2毒素多抗血清,建立T-2毒素免疫学检测方法。采用N,N'-羰基二咪唑(CDI)法合成完全抗原T-2-BSA和包被原T-2-OVA,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和动物免疫试验对合成的完全抗原进行鉴定,优化ELISA反应条件,建立T-2毒素间接竞争ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,完全抗原T-2-BSA合成成功;动物试验结果显示,制备的完全抗原能够刺激小鼠产生针对T-2毒素的特异性抗体;基于该抗体所建立的T-2毒素间接竞争ELISA检测方法的灵敏度(IC50)为8.34 ng/m L,检测限(LOD)为0.048 ng/m L。综上,成功合成了完全抗原T-2-BSA,获得了效价高、敏感性强的抗T-2毒素的鼠源多克隆抗体,并初步建立了T-2毒素免疫学检测方法。     

抗猪脂肪细胞膜单链抗体基因的构建及鉴定

应用噬菌体展示技术，从猪脂肪细胞免疫的小鼠脾细胞mRNA中构建出单链抗体(scFv)cDNA文库。cDNA文库克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E，转化E.coli TG1,通过噬菌体表面展示，用猪脂肪细胞对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行3轮亲和富集，筛选出了猪脂肪细胞膜scFv，为今后的应用奠定了基础。     

2014-2016年河南省猪伪狂犬野毒感染和免疫情况血清学调查

调查河南省猪群伪狂犬野毒感染流行情况,为制订合理的防控与净化策略提供参考依据.于2014年1月-2016年5月,采集河南省不同地域780个猪场16 200份血清样本,使用gE-ELISA鉴别诊断方法进行血清学调查,对10个阳性稳定猪场和10个阳性发病猪场进行血清学分析,对2个后备母猪培育场(1个为阴性场,另1个为阳性场)进行生产成绩分析,同时对猪场伪狂犬gE基因缺失疫苗使用情况进行调查,并跟踪了40个猪场的疫苗免疫情况.结果显示,河南省猪场伪狂犬gE抗体阳性率90.0％,血清样本阳性率46.2％,成年种猪阳性率53.1％,后备种猪阳性率27.6％.猪群在阳性发病场的阳性率高于在阳性稳定场的阳性率,育肥猪感染带毒严重影响其生产成绩,猪场伪狂犬疫苗免疫强度呈现增加趋势.综上可知,目前河南省猪群伪狂犬野毒感染情况比较严重.     

温度敏感型可注射水凝胶的性质及应用研究进展

温度敏感型可注射水凝胶是一种对温度敏感的新型材料,可以随着温度的变化发生物理状态的变化。由于这种特性,该水凝胶材料近年来被广泛的应用于疫苗和药物控释以及组织支架工程等领域。温度敏感型可注射水凝胶材料根据其结构的不同大致可分为5个种类,论文对这5种材料的温变机制、生物相容性、毒性、可降解性等性质进行了综述,阐述了每种材料的特点,并对各个材料在药物疫苗传递系统和组织支架工程两方面的应用研究进展分别进行了归纳和总结,为温度敏感型可注射水凝胶在人类和动物医学领域的应用提供科学依据,并对其未来发展前景进行展望。     

试论农业气象预报方法的发展

自20世纪60年代开始,随着气候的恶劣和粮食危机的爆发,农业气象预报就受到了全社会高度的关注。虽然目前世界各地的农业气象预报种类繁多,并且各自采用的方法也不尽相同,但是其归根结底都离不开气象预报的最核心内容,这些内容包括天气学、气候学、统计学、模拟学和遥感技术等,而几十年来,农业气象预报的发展也不外乎是这几方面技术的提高。在目前科技日益发达的社会环境下,粮食依旧是人类赖以生存的基础,所以,农业气象的预报依然具有重要的意义。鉴于此,本文针对农业气象的预报做出了简析,并对预报方法的发展提出了一些见解。     

口蹄疫3D蛋白N端T细胞表位重组蛋白的表达、纯化及鉴定

为获得具有抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)3D蛋白N端T细胞表位的重组表达蛋白,根据FMDV3D蛋白前115位氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET-28a中,构建原核表达质粒pET28a-115,并将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-bolt鉴定,结果显示,在16kD处有一条明显的蛋白表达条带。对表达产物进行可溶性分析,结果表达蛋白50%为可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后获得了较高浓度和纯度的目的蛋白。研究结果表明,含FMDV 3D蛋白前115位氨基酸的重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,并具有较好的抗原活性,为开发口蹄疫诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。     

2014年第1季度猪伪狂犬病流行病学调查及防控建议

2014年1-3月份,笔者实验室为147个猪场提供了检测技术服务,其中对138个猪场进行了伪狂犬病相关检测。采用gEELISA（美国IDXX试剂盒）方法对3 281份血清进行野毒抗体鉴别诊断,使用PCR方法对61份组织进行病原检测。通过对检测数据的汇总和分析,与2013年相比,2014年第1季度伪狂犬病感染率有上升趋势,防控形势依然严峻。详细情况汇总如下。     

2013年河南省猪伪狂犬野毒感染血清学调查

伪狂犬病是一种严重威胁养猪业的重要传染病,2012年以来该病在河南省大面积流行,对养猪业造成了巨大影响。本研究利用g E-ELISA方法,对2013年来自河南省不同区域不同规模347个猪场的13 275份血清样本进行检测分析。结果显示血清样本阳性率31.3%,猪场阳性率83.6%。种猪群带毒率高,育肥阶段伪狂犬病毒感染情况尤其严重。但一些生产管理较好的规模化猪场通过采取强化免疫,不断补入阴性后备种猪,加强生物安全等综合措施,成功防控了伪狂犬疫情。本研究对于了解当前河南省伪狂犬疫情,制订正确的防控策略提供了依据。