TPL2促进口蹄疫病毒在BHK-21细胞复制

为研究肿瘤进行性位点2(TPL2)在仓鼠肾细胞(BHK-21)中对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,使用FMDV感染BHK-21细胞,通过qRT-PCR技术检测FMDV感染对内源性TPL2转录水平的影响;根据GenBank公布的TPL2基因序列(NM007746.2)设计构建TPL2的真核表达质粒以及设计并合成宿主TPL2的RNAi序列,利用脂质体方法转染BHK-21细胞,通过qRT-PCR和Western blotting技术分析TPL2在BHK-21细胞过表达和干扰对FMDV复制的影响。结果表明,FMDV感染BHK-21细胞后,TPL2转录水平显著上调;过表达TPL2能够促进FMDV在BHK-21细胞中复制,而下调表达内源性TPL2后FMDV的复制受到抑制,表明TPL2促进FMDV在BHK-21细胞中进行复制,本结果进一步拓展了我们对FMDV与天然免疫机制之间关系的认识,同时为TPL2的相关研究积累了科学资料。     

PCBP2促进口蹄疫病毒增殖的机制研究

多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)是一个能特异性结合RNA和DNA Poly(C)片段的蛋白,具有维持mRNA稳定和调节翻译的功能;同时,PCBP2能负调控VISA介导的信号转导通路,抑制Ⅰ型干扰素(IFNs)的产生。前期研究表明,PCBP2能调节口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的增殖,但具体机制不清楚。作者对此进行了研究,发现:1)免疫共沉淀和GST pull-down试验证实,PCBP2能与FMDV结构蛋白VP0、VP2、2B、2C和3D相互作用;2)进一步用双荧光素酶报告系统试验证明,PCBP2负调控VISA介导的信号通路,并且2C、3D、VP0和2B促进PCBP2的负调控作用;3)通过Western blot试验表明,FMDV VP0蛋白能促进PCBP2对VISA的特异性降解。总之,PCBP2与FMDV VP0相互作用,促进PCBP2降解天然免疫接头蛋白VISA,抑制IFN-β的产生,从而有利于FMDV在细胞中的繁殖和生长。     

CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及免疫原性分析

旨在利用悬浮培养CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV) E2蛋白,并鉴定纯化E2蛋白的免疫原性。本研究以BVDV-1 NADL株基因序列为基础,构建BVDV E2蛋白的重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2,转染经悬浮培养的CHO细胞进行分泌表达,收集细胞培养上清,进行亲和层析法纯化,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达和纯化,Western blot鉴定与His抗体和BVDV阳性血清反应性,利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔,用细胞间接免疫荧光(IFA)和ELISA鉴定E2蛋白的反应活性。纯化E2蛋白经BCA蛋白定量试剂盒检测后表达量高达1.228 mg·mL^-1;Western blot结果显示,利用His抗体和BVDV阳性血清均可检测到目的蛋白的特异性条带;新西兰大白兔一免后第7天利用间接ELISA可检测到血清抗体阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平达到1∶1 024 000;IFA试验结果显示,该血清抗体可检测到BVDV感染MDBK细胞中E2蛋白的表达,进一步证实纯化的E2蛋白具有良好的免疫原性和特异性。本研究成功利用CHO悬浮培养真核表达系统制备了纯化的BVDV E2蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为BVDV的诊断方法及其新型亚单位疫苗研制奠定了基础。     

牛口蹄疫病毒受体β6亚基的基因克隆和分子特征

从口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染康复牛的舌皮组织中克隆到了β6亚基基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸进行了比较分析。牛β6基因的编码区含有2367个核苷酸,编码788个氨基酸残基,其中信号肽由26个氨基酸组成（1～26aa）;胞外域由681个氨基酸组成,含有10个潜在的糖基化位点（NXT/NXS）和51个半胱氨酸（Cys）残基;跨膜区由29个氨基酸组成（708～736aa）;胞浆域由52个氨基酸组成,含有1个NPLY核心基序,该基因在GenBank中的登录号为DQ867017。牛β6基因与羊、猪、人、小鼠、挪威大鼠β6基因的核苷酸序列同源性分别为97.0%、91.6%、88.6%、82.5%和82.7%,推导的氨基酸序列同源性分别为97.1%、93.7%、93.0%、89.2%和89.2%。口蹄疫病毒自然宿主（牛、羊、猪）的β6亲缘关系较近,提示β6亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。     

非典型性猪瘟的诊断

猪瘟(Swine Fever)又名猪霍乱(Hog Cholera ,HC),它是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种急性﹑高度接触性传染病,欧洲人称之为古典猪瘟.家猪和野猪均是CSFV的自然宿主..     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定

[目的] 研究口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定。[方法] 以含有FMDV 3ABC基因的质粒为模板,应用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因并进行序列测定,将3AB基因克隆至表达载体pET-28a（＋）,选取阳性克隆转化BL21感受态用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-bolt检测分析。[结果] 经SDS-PAGE和Western-bolt分析表明,在大肠杆菌中成功表达了3AB蛋白,表达的目的蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。[结论] 该项研究为应用以重组FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫动物的鉴别诊断方法提供了依据。     

猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析

[目的]鉴定由猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭（编号为HN/XT）发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。     

猪瘟流行野毒株E_2基因编码的gp55蛋白模拟分析

利用RT-PCR和PCR技术扩增出近期猪瘟流行野毒株的E2基因,将其克隆到载体上测定核苷酸序列,根据Alfort株和Brescia株、C-株确定起始氨基酸三联体的正确位置后推导出其氨基酸序列,结果表明近期流行的猪瘟毒株与疫苗毒株和强毒株之间存在一定差异;利用DNAstar软件分析E2基因编码的gp55蛋白的疏水性、抗原性和二级结构,并与猪瘟疫苗毒株(C-株)进行比较,结果表明,目前流行的猪瘟病毒与疫苗毒的gp55蛋白在抗原性、二级结构上存在一定的差异,而C末端疏水性差异不大。     

重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性

从实验感染兔脾组织中提取总RNA，应用RT—PCR得到了CSFVC-株结构蛋白E2基因，定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro，经PCR、酶切和序列分析鉴定，获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载pVSV—G共转染GP2—293细胞，收获假型病毒，并在Polybrene的介导下感染PK15细胞，嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明，所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因，而且表达产物具有良好的生物学活性。