悬浮培养Sf21细胞高效表达牛γ-干扰素及其特性鉴定

本试验旨在研究重组牛γ-干扰素(rBovIFN-γ)在Sf21细胞中高效表达及其特性鉴定。利用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从奶牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出不含信号肽的BovIFN-γ基因片段。将其克隆到pFastBac^TMHTA中构建重组质粒pFastBac^TMHTA-BovIFN-γ。然后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-BovIFN-γ。转染Sf21昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBac-BovIFN-γ,应用Sf21细胞悬浮培养技术大量表达rBovIFN-γ。利用Western blotting、质谱分析(MS)、抗病毒试验等对rBovIFN-γ进行鉴定。Western blotting分析显示,rBovIFN-γ具有良好的反应原性;MS分析表明,rBovIFN-γ的6个肽段序列与牛IFN-γ的氨基酸序列完全匹配,在蛋白质质谱数据库中搜索结果为牛IFN-γ;MDBK/VSV抗病毒试验显示,rBovIFN-γ具有很高的抗病毒活性,为1.05×10⁵ IU/mg。     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95- (C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。     

牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

试验旨在构建牛分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物学活性。采用PCR技术扩增并克隆牛分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261-Mbeis,经双酶切和测序鉴定其正确性,利用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc²155中,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达,质谱鉴定目的蛋白氨基酸序列。研究结果表明,成功构建了牛分枝杆菌eis基因穿梭表达载体pMV261-Mbeis;生长曲线表明负载重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE和Western blotting检测证实了牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中可表达出分子质量约44 ku的eis蛋白;质谱检测证明了该蛋白即为牛分枝杆菌eis蛋白。本研究构建的牛分枝杆菌eis基因穿梭表达质粒pMV261-Mbeis在耻垢分枝杆菌中具有生物学活性,为下一步研究表达产物eis蛋白的功能奠定了基础。     

高寒地区井灌水稻施钾肥的效果

高寒地区井灌水稻施钾肥的效果韩秉进（中国科学院黑龙江农业现代化研究所哈尔滨１５００４０）贾红，郑贵仁，陈景宽，吴长义（黑龙江省绥化市农业技术推广中心１５２０６２）随着水稻旱育稀植技术的深入推广，水稻栽培区域的界限已进一步向北移，栽培面积不断扩大，同时...     

非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

试验旨在构建非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）EP153R基因原核表达系统,表达EP153R重组蛋白（rEP153R）,并制备抗rEP153R的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1的EP153R基因序列（GenBank登录号：FR682468.1）合成EP153R基因序列,并将其插入pET-28a载体,构建pET-28a-EP153R重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,分别在16和37 ℃条件下经IPTG诱导12 h进行最适诱导温度筛选。在最适温度下进行重组蛋白的表达,并利用SDS-PAGE、Western blotting进行初步鉴定。切取SDS-PAGE蛋白胶25 ku处条带,利用液相色谱－质谱联用技术鉴定重组蛋白是否正确表达。用纯化的rEP153R免疫小鼠,制备抗rEP153R的多克隆抗体,通过间接ELISA检测其抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果显示,重组菌在16 ℃表达量较高,并以包涵体形式表达,产物在25 ku处出现明显的条带,与预期蛋白大小相符,表明rEP153R成功表达。液相色谱－质谱联用技术鉴定结果显示,匹配到YIGLINK、NESVLLR和KYIGLINK 3个rEP153R的特异性肽段,证实该蛋白为rEP153R。间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶128 000;Western blotting结果显示,制备的抗体具有较好的特异性。以上结果表明本研究成功表达了rEP153R,并制备了其特异性抗体,为进一步研究该蛋白生物学功能、非洲猪瘟活载体疫苗鉴定等提供了技术支持和材料。     

GFS和T639模式气温产品的检验分析

[目的]检验分析GFS和T639模式的气温预报能力。[方法]采用2012年徐州站最高气温和最低气温资料,对GFS模式和T639模式0~168 h最高气温和最低气温预报产品进行检验。[结果]无论是最高气温还是最低气温,GFS和T639 2个模式气温预报产品的预报准确率均随着时效的延长呈现波动下降,夏季最低气温的预报准确率整体上均高于其他季节;各个模式不同季节不同时效的气温预报的偏低率和偏高率明显不同;随着预报时效的增加,2个模式预报气温产品平均绝对误差逐渐增大,但总体上,夏季的误差小于其他季节。总体上来看,GFS模式预报效果优于T639模式。[结论]该研究为预报员合理使用数值预报产品、提高气温的预报准确率提供指导。     

细粒棘球蚴Eg95s基因的串联表达及表达系统优化

为研制新型棘球蚴病基因工程疫苗,根据GenBank公布的细粒棘球蚴Eg95基因序列,针对其中一段348 bp高度亲水的优势表位序列设计引物,扩增Eg95s基因,利用同尾酶法基因同向串联方案,获得3拷贝Eg95s串联体.分别用两种表达载体pGEX-6p-1和pET-32a构建重组质粒,转化入3种大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)、Rosseta(DE3)和Orjgami(DE3),对其进行IPTG诱导表达,经免疫印迹分析结果表明,均能正确表达具有免疫原性的Eg95s蛋白.通过重组蛋白的表达量、可溶性、纯化方法等方面的比较,对Eg95s重组表达系统的载体及宿主菌进行了优化,结果表明,3拷贝的串联Eg95s在以pET-32a为表达载体,Rosseta(DE3)为宿主菌的系统中表达最佳.最终获得了表达量高、可溶性好、纯化方便的Eg95s重组蛋白表达系统,为大规模生产棘球蚴病基因工程疫苗提供了科学依据.     

徐州市农田土壤墒情精细化评估业务系统

农田土壤墒情是影响农业生产的关键因子之一.为解决传统农田土壤墒情监测点少、监测时效差、区域分布评估困难等问题,基于CLDAS土壤湿度分析产品,通过Python编程语言,建立徐州市农田土壤墒情精细化评估业务系统.结果表明,该系统操作简便,能够实现农田土壤墒情全面、准确、快速、滚动监测,满足了农田土壤墒情大范围区域化评估和...     

徐州市重污染期碳质组分、水溶性离子特征及来源解析

基于美国沙漠所研制的Model 2001A热/光碳分析仪对徐州市区2016年冬季重污染时期PM2.5中的碳质组分[有机碳(OC)和元素碳(EC)]以及水溶性离子(NO_3~-、SO_4~(2-)、F~-、Cl~-、NO_2~-、NH_4~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Na~+)进行昼夜采样监测,并采用优化的MRS算法对二次有机碳(SOC)含量进行了估算。结果表明,在采样期间徐州市区PM2.5平均质量浓度达到了(129.7±37.0)μg/m~3。通过OC/EC比值分析,采样期间徐州市区碳质气溶胶主要受到汽油车和柴油车尾气排放影响。SOC平均质量浓度为3.4μg/m~3,对OC的贡献达了44.3%,且夜晚二次污染程度要大于白天。重污染时期水溶性离子平均质量浓度达到了(126.0±24.0)μg/m~3,3种主要水溶性离子(NO_3~-、SO_4~(2-)、NH_4~+)以NH_4NO_3、(NH_4)_2SO_4的形式存在。通过对NO_3~-、SO_4~(2-)质量浓度比值的分析,表明以燃煤为主的固定源对水溶性离子贡献较大。利用PMF模型分析重污染期间大气PM2.5的质量浓度来源主要有6个,分别为交通源(48.7%)、二次无机气溶胶污染源(24.3%)、海盐及燃煤燃烧源(14.9%)、二次化工污染源(12.1%)、生物质燃烧源(0.9%)、道路扬尘源(0.1%)。总体来说,大气中PM2.5的来源较为多源化,其中交通源以及二次无机气溶胶污染源占据主导地位。     

犬弓首蛔虫C型凝集素4的原核表达及组织定位

旨在探讨犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)C型凝集素4(C-type lectin 4,C-TL-4)的基因特征，并对其组织分布进行研究。根据Tc-ctl-4的基因组数据(GenBank:AF126830.1),以T.canis为模板对Tc-ctl-4全长基因进行扩增，并进行序列分析和多重序列比对；构建Tc-ctl-4/pCold TF原核表达载体，对重组蛋白进行纯化并制备多克隆抗体；同时采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和间接免疫荧光组化检测Tc-ctl-4基因的转录水平和Tc-CTL-4的组织分布。结果显示，Tc-ctl-4基因的全长序列为842 bp,共编码280个氨基酸，多重序列比对显示，犬弓首蛔虫和猫弓首蛔虫的C型凝集素均含有高度保守的CTLD结构域；SDS-PAGE检测发现重组蛋白Tc-CTL-4的大小约为86 ku,以可溶性形式表达；利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白，以500 mmol·L^-1咪唑进行洗脱时可获得高纯度的目的蛋白；将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制...