猪圆环病毒Ⅱ型新疆分离株全基因组及ORF2基因的克隆与测序

根据GenBank中已发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物。将PCV2新疆分离株(PCV2-XJ)用PK15细胞培养数代,从细胞培养物中提取病毒总DNA,并取其作为模板,PCR扩增出病毒全基因和结构基因(ORF2)。将PCR回收产物克隆到pMD18-T载体,成功构建了重组质粒pMD18-TPCV2和pMD18-T-ORF2,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的PCV2-XJ基因组全长1 768 bp。通过序列分析结果显示,PCV2-XJ与国内外PCV1、PCV2参考毒株的核苷酸同源性分别为99.5%～99.7%和68.7%;与HuB08(FJ041151)参考株核苷酸同源性最高(99.7%)。PCV2-XJ株ORF2基因与参考株核苷酸和氨基酸同源性分别高达99.3%和98.8%。     

猪瘟活疫苗(脾淋源)组织毒生产工艺改进试验

脾淋源猪瘟活疫苗使用的脾淋组织毒生产繁琐,家兔热型判定中测温次数多,工作量大。通过统计、对比,试验在大量测定取得基础体温的基础上,使用48 h、72 h两个时间点测温的方法,进行热型判定,与规程[1]要求生产方法比较,取得较好的一致性,并对最终产品进行效力对比,结果无差异。     

传染性支气管炎重组鸡痘病毒免疫鸡对LHLJ04X I株病毒攻击的免疫保护作用

将表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IFN-γ S1）接种SPF鸡后,用与S1基因亲本毒株具有相同致病型且遗传关系较近的现地分离株LHLJ04XI病毒进行攻击．评价重组疫苗对现地分离病毒的保护效果。结果显示,重组病毒在免疫后1周即可检出ELISA抗体,并且免疫组外周血CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量均有显著上升。当用LHLJ04XI株病毒及亲本毒LX4攻击后,免疫鸡的肝脏、肾脏、脾脏及肺脏等脏器的病理损伤程度明显轻于非免疫对照组,排毒时间缩短,攻毒后现地分离株攻击的免疫组的发病率为27.3％（3／11）,死亡率为9．1％（1／11）,亲本毒攻击的免疫组发病率为26．67％（4／15）,死亡率为6．67％（1／15）,两者没有明显差异,而非免疫对照组的发病率和死亡率分别为100％（11／11）和45．5％（5／11）,与免疫组相比差异显著,说明重组疫苗对免疫鸡具有较好的保护效果。体重测定结果表明,攻毒前重组疫苗免疫组和非免疫对照组的体重差异不显著（P〉0．05）,攻毒以后免疫组体重的增加幅度高于非免疫对照组。以上结果表明,共表达鸡IFN-^γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒活载体疫苗能对异源现地分离株的攻击产生较好的免疫保护,同时也减轻了重组疫苗对体重增长的抑制作用。     

共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒部分生物学特性测定

将共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγS1)接种4周龄SPF鸡,免疫3周后用异源病毒LSC99I株攻击,考察重组疫苗对异源病毒攻击的保护作用。结果显示,疫苗接种后,免疫鸡血清中很快出现抗体;外周血中CD4 和CD8 T淋巴细胞的百分含量略高于非免疫对照组,但这种差异并不显著。LSC99I株IB病毒攻击后的保护率结果表明,免疫组的发病率为50%(5/10),死亡率为20%(2/10),非免疫对照组的发病率为100%(10/10),死亡率为50%(5/10);另外免疫鸡的病理损伤程度与非免疫对照组相比,二者差异不明显,在排毒时间和排毒量上也没有明显变化。体重分析结果显示,攻毒前免疫组与对照组相比,体重均没有显著变化,但攻毒后免疫组鸡体重增长的幅度要高于非免疫对照组。从以上结果可以说明,重组疫苗虽然能在动物体内很好地表达,但不能对实验动物产生很好的保护作用,而鸡干扰素-γ基因能在动物体内表达并发挥其免疫调节作用,减轻了重组疫苗对体重增长的影响。     

不同厂家猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效力对比实验

本研究旨在评价不同厂家猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫攻毒保护效果。选择4周龄仔猪25头,随机分为5组,每组5头猪,分别免疫四种猪肺炎支原体灭活疫苗（即疫苗A组、疫苗B组、疫苗C组、疫苗D组）,E组为攻毒对照组,不做任何处理,在同等条件下隔离饲养。各疫苗按照对应的说明书进行免疫,免疫后第14、28天进行采血,检测支原体抗体水平,一免后28 d时,所有免疫组连同攻毒对照组,各气管注射猪肺炎支原体CJ株5 m L/头（含0.01 g肺组织毒）。攻毒后饲养观察28 d,对所有实验组动物进行观察临床症状。A组实验动物攻毒后未出现咳嗽、腹式呼吸等支原体临床症状,B-D组实验猪攻毒后偶尔出现轻微间隔性咳嗽,E组实验动物攻毒后出现连续性咳嗽,个别猪出现腹式呼吸等临床症状。攻毒后第28天进行病理剖检。结果表明,攻毒对照组猪4/5头出现典型猪肺炎支原体病变,在肺脏尖叶、心叶、膈叶前1/3部位以及中间叶,出现“肉样”或“胰样”实质样病变,界限明显。B～D组解剖后个别猪出现典型猪肺炎支原体病变,A组实验动物解剖后个别猪肺脏出现零星病变,剩余实验动物肺脏均未出现猪肺炎支原体病变。根据肺部病变较少率计算,A～D组病变...     

猪瘟E2亚单位疫苗和猪口蹄疫O型/A型二价灭活疫苗联合免疫的临床评价

在非洲猪瘟成为常态化的背景下,疫苗的联合使用可有效优化、重构猪群的免疫程序,在保证防控重大疫病的前提下,减少猪群免疫负担和应激,降低免疫苗时感染非洲猪瘟的风险。为此,本研究用猪瘟E2亚单位疫苗和猪口蹄疫O型/A型二价灭活疫苗在实验室进行混合,测试了其物理性状,并在田间进行了安全性、有效性的临床研究。研究结果表明,2种疫苗按不同比例混合后呈剂型与占比较大的疫苗剂型相同,黏度、通针性均优于猪瘟E2亚单位疫苗,在2～8℃保存7天后,疫苗均一、稳定,未见分层,离心后无水相析出;采用间隔免疫、同步分点注射、同步混合注射的方式免疫试验猪均未引起免疫副反应,同步混合注射的免疫效果优于其他试验组,但各组间差异不显著(P>0.05),未见免疫干扰现象。本研究证实猪瘟E2亚单位疫苗和猪口蹄疫O型/A型二价灭活疫苗可同步混合免疫,不仅安全有效,而且降低了猪群免疫负担和兽医免疫劳动强度,适合在临床中大面积推广应用。     

牛支原体新疆分离株P48基因克隆及分子特征分析

本研究旨在分析牛支原体P48基因的序列特性、蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株P48基因序列（GenBank登录号：CP002188.1）设计特异性引物,运用Overlap-PCR扩增获得P48基因全长,其目的片段连接到pMD19-T载体上并进行测序,利用生物信息学方法分析和预测其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、结构功能（信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构和三级结构）。结果显示,分离株P48基因序列为1 407 bp,与Mb PG45国际标准株的同源性为100%,聚类于一支;P48基因编码467个氨基酸残基,组成一个无跨膜、稳定的亲水性蛋白;P48蛋白存在信号肽,有44个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（41.76%）,无规则卷曲次之（37.69%）。功能预测显示,在信号转导、胁迫应答、受体等方面该蛋白存在较高概率。本研究成功克隆了分离株P48基因片段,其编码的蛋白是一个稳定可溶、亲水性蛋白,为分析分离株P48基因的特性和功能提供了一定的理论基础和科学依据。     

新疆部分规模化猪场猪病毒性腹泻流行病学调查与防控

2011年11月—2012年12月,对新疆部分规模化猪场开展了猪病毒性腹泻病的流行病学和病原学调查。结果表明,本病发生传播快,无明显季节性,主要造成10日龄内的仔猪腹泻、呕吐、脱水死亡,发病率10%～50%,死亡率可达100%。通过实验室检测,10家调查猪场送检的259份临床病料中猪流行性腹泻病毒阳性163份,库伯病毒阳性97份,猪流行性腹泻病毒、库伯病毒混合感染96份,未检出传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒。因此,对于新疆猪流行性腹泻病毒阴性规模化猪场应制定有效、可行的猪流行性腹泻病毒综合防控措施,防止猪流行性腹泻病毒感染造成严重经济损失。     

牛支原体新疆株的分离鉴定

为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。     

口蹄疫双佐剂灭活疫苗的研究

在口蹄疫二价灭活疫苗（O型、AsiaⅠ型）常规使用法国SEPPIC公司206佐剂的基础上,设计了一种缓释作用更强的双佐剂成分疫苗。通过MTT法检测淋巴细胞增殖能力、液相阻断ELISA法检测口蹄疫抗体效价及攻毒试验测定PD50来评判该双佐剂疫苗与常规疫苗的效果差异。结果显示,双佐剂疫苗组细胞免疫水平（淋巴细胞刺激指数SI为1.235±0.060）比常规佐剂疫苗组（SI为1.115±0.035）和对照组（SI为1.010±0.045）高,与常规疫苗组相比差异显著（P＜0.05）,与空白对照组相比,差异极显著（P＜0.01）。双佐剂疫苗组O型和AsiaⅠ型抗体与常规佐剂疫苗组相比,全剂量组抗原量较充分,两组抗体水平差距不大;1/3剂量组和1/9剂量组由于抗原量较少和强缓释作用,导致抗体水平明显较低。攻毒保护结果为双佐剂疫苗组略高于常规佐剂疫苗组,前者每头份疫苗AsiaⅠ型为9.0 PD50,O型为11.84 PD50,后者每头份疫苗AsiaⅠ型为9.0 PD50,O型为9.0 PD50。由分析结果可见,双佐剂疫苗可引起较好的细胞免疫应答和缓释作用,达到好的攻毒保护效果。