禽传染性支气管炎病毒S2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备禽传染性支气管炎病毒(IBV) S2蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化重组S2蛋白,将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到4株能够稳定分泌S2蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7、4F12、4A7、4D1。亚类鉴定结果显示4株MAb的重链均为Ig G1,轻链均为κ。采用间接ELISA法检测上清及腹水效价,结果显示MAb细胞上清效价均不低于1∶12 800,腹水效价均不低于1∶51 200。采用western blot检测制备的S2蛋白MAb与IBV感染鸡胚尿囊液后天然表达的S2蛋白的反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测IBV感染非洲绿猴肾细胞(Vero)后天然表达的S2蛋白的反应原性。Western blot结果显示,感染IBV的鸡胚尿囊液中出现了90 ku左右的特异性条带;IFA结果显示,感染IBV的Vero细胞中出现绿色荧光。以上结果表明,制备的S2蛋白MAb能够与天然表达的S2蛋白反应,反应原性较强。利用间接ELISA检测MAb与S2蛋白的亲和力,结果显示4株MAb对S2蛋白均有良好的亲和力。利用一系列表达部分重叠的重...     

鸡IL-6、IL-17和IFN-γ实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台.     

7种食源性致病菌GeXP多重PCR检测方法的建立及其应用

本研究旨在建立一种能够同时鉴别包括大肠杆菌O157：H7、沙门菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌7种常见食源性致病菌的GeXP多重PCR检测方法。根据这些致病菌在GenBank上公布的保守基因序列,设计合成了7对特异性GeXP引物。用单一或混合细菌样品的DNA模板优化反应条件,设置对照组,构建重组质粒,随机组合不同浓度的样品,验证所建立的GeXP方法的特异性、敏感性和准确性。最后用该方法检测120份临床样品,进一步验证所建立的GeXP检测方法的准确性和可靠性。结果显示,单一或混合模板的GeXP检测均能特异性出现相应清晰峰值,可在10³拷贝·μL^-1水平上同时特异地检测出7种细菌病原体,不同浓度模板混合时,本试验所建立的方法依然可检测出对应病原体。检测120份临床样品,GeXP多重PCR阳性率为2.50%（3/120）~15.83%（19/120）,普通PCR阳性率为2.50%（3/120）~15.00%（18/120）,GeXP多重PCR多检出8份阳性,表明GeXP方法更为敏感与准确。本研究建立的同时鉴别7种食源性致病菌的GeXP多重PCR检测方法,具有高通量、特异性强和敏感性高的特点,为食源性常见致病菌感染或混合感染提供了快速分子诊断方法。     

青鳉tsn的克隆与表达分析

有性繁殖的性别决定机制虽具有多样性,但其生殖细胞都经过几轮有丝分裂和增殖后进入减数分裂,最终产生雌性或雄性配子。尽管有丝分裂过程中的生殖细胞在形态上没有雌雄差异,然而,未分化的生殖细胞在有丝分裂过程中如何获得雌雄性别特征尚不清楚。青鳉(Oryzias latipes)正常XX卵巢、正常XY精巢以及性腺体细胞衍生因子(gonadal soma-derived factor,gsdf)缺失型(gsdf^-/-)卵巢的蛋白质组学质谱比对分析结果显示,gsdf^-/-XY卵巢中Tsn(Translin)蛋白产物显著高于gsdf^-/-XX卵巢,提示Tsn蛋白表达可能受dmy(DM-domain on Y chromosome,又名dmrt1bY)及下游Gsdf雄性信号调控。从青鳉性腺组织的cDNA中克隆了tsn基因的ORF(Open Reading Frame)片段。氨基酸序列的同源性比对分析及系统发育树评估显示,Tsn在脊椎动物物种间具有进化保守性,青鳉和斑马鱼(Danio rerio)的Tsn氨基酸序列高度同源。反转录PCR和实时荧光定量PCR检测结果显示,tsn的mRNA在野生型青鳉多个组织中广泛表达,其中在精巢中的表达量显著高于卵巢。免疫荧光检测发现,gsdf^-/-XY卵巢中抗青鳉Tsn抗体阳性反应的囊性生殖细胞异常增多,同蛋白组学分析得到的gsdf^-/-XY卵巢中Tsn蛋白表达量高于gsdf^-/-XX卵巢的结果相一致。在青鳉性腺分化发育过程中,Gsdf信号可能抑制Tsn阳性的雄性囊性生殖细胞增殖,当该信号被破坏后,这种抑制作用消失,导致Tsn阳性生殖细胞在gsdf^-/-XY卵巢中大量积累。青鳉Tsn阳性生殖细胞的囊性增殖,是青鳉有丝分裂期生殖细胞雄性分化的特征之一,为脊椎动物有丝分裂期生殖细胞的雌雄性别鉴定提供了线索。     

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒（CSFV）及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）,为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据GenBank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性（翠绿色）,其他非CSFV样本的检测结果均为阴性（桔红色）,且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。     

赣州烟区主要病虫害绿色防控技术体系示范效果分析

对比国内烟叶产区绿色防控技术体系,结果表明,赣州烟区所实施推广应用的绿色防控技术体系,对提高病虫害防治效果、保障烟叶质量安全、提高烟农收益具有重要意义,值得推广.该研究为绿色防控技术在赣州烟区的全面推广奠定基础.     

双季杂交稻耕作系统中养分与农药管理对土壤微生物活性的影响

 田间实验表明在不同的管理方式和不同生长期所研究的土壤参数均发生显著变化。土壤微生物生物量/磷脂含量随水稻生长期延长而显著减少，同时，单独施用肥料或农药和同时施用肥料和农药均导致土壤微生物生物量/磷脂含量发生一定变化，单独施用农药的土壤中土壤微生物生物量/磷脂含量最低。异养型细菌和蛋白质分解菌数量随水稻生长期延长持续减少，单独施用农药的土壤中异养型细菌和蛋白质分解菌数量最少，异养型细菌和蛋白质分解菌数量的变化趋势与土壤微生物生物量/磷脂含量相似。电子运输系统/脱氢酶活度随水稻生长期延长持续增强。与对照相比，单独施用肥料或同施农药和肥料导致土壤中电子运输系统活度增强，而单独施用农药土壤中电子运输系统活度明显下降。单独施用肥料或农药及同时施用肥料和农药处理中，土壤中蛋白质含量相对稳定，但在不同生长期存在较大变化。关键词     

禽呼肠孤病毒σNS和P17非结构蛋白作为ELISA鉴别诊断抗原的研究

表达并纯化了禽呼肠孤病毒(ARV)的2个非结构蛋白σNS和P17,并以此作为包被用抗原,分别进行间接ELISA。结果表明,抗原最佳包被浓度分别为9.3μg/mL和11.5μg/mL;一抗血清的稀释度都是1∶200;HRP酶标二抗羊抗鸡IgG稀释度为1∶5 000,初步建立了能检测ARV感染的σNS-ELISA、P17-ELISA方法。以σNS、P17两种蛋白按以上确定的条件同时包被,建立了σNS-P17-ELISA。分别用σNS-ELISA、P17-ELISA及σNS-P17-ELISA对接种过ARV活病毒或灭活疫苗的33份SPF鸡血清进行检测,结果发现以非结构蛋白建立的3种ELISA方法均能区分ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的抗体,进一步对这3种方法进行敏感性、特异性分析比较,表明σNS-P17-ELISA方法能更有效地区分ARV感染与灭活疫苗免疫抗体。