猪博卡病毒NP1基因的克隆与原核表达

猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒.本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,...     

2013～2014年猪嵴病毒分子检测和3D基因遗传变异分析

[目的]为调查猪嵴病毒（ PKV）在我国哺乳仔猪中的流行和变异情况。[方法]采集2013～2014年我国5个省份27个猪场224份哺乳仔猪腹泻粪样,采用 RT-PCR方法对 PKV的3D基因进行检测,并对其中的29个 PKV 3D基因进行序列测定和遗传变异分析。[结果]腹泻粪样中PKV总阳性率为65.18％（146/224）,猪场PKV总阳性率为85.2％（23/27);29个 PKV 3D基因与国内外6株其他 PKV株相关序列的核苷酸同源性为87.0％～100％,所推导的氨基酸序列同源性为92.7％～100％。[结论]我国哺乳仔猪中普遍存在 PKV感染,PKV 3D基因呈现多样性。     

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较（英文）

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和Taq Man探针,构建分别包含PCV2 ORF1和ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于PCV2 ORF1和ORF2的Taq Man荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101copies/μl,ORF2方法可达1.0×102copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

猪伪狂犬病的净化策略

鉴于2012年后猪伪狂犬病在国内的流行呈逐年上升的趋势,其是引起目前生长猪群发生呼吸道疾病综合征和母猪发生流产的主要病原,1986年Vanoirschot首先建立了针对g E的阻断ELISA方法,该方法自建立起,已经在全世界得到了广泛应用,且过去几十年,世界上一些主要伪狂犬病流行国家相继启动了根除计划并已取得了成功。目前猪伪狂犬病的净化已被列入国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)。江苏省农业科学院动物疫病诊断检测中心在借鉴国外伪狂犬病净化成功经验的基础上,进行了江苏省目前养猪条件下种猪场猪伪狂犬病净化策略的研究,通过一年多的实践发现"免疫→检测→淘汰→补充阴性后备猪→免疫→检测→淘汰"的净化措施是切实可行的,江苏省的2家规模种猪场在实施猪伪狂犬病的根除计划后已取得了一定成效,具有推广价值。     

2008-2010年中国华东地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析

 【目的】对来自2008-2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。【方法】利用RT-PCR方法对采集的样品进行PRRSV检测,并对PRRSV检测呈阳性的36份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。【结果】260份病料中共检测到118份PRRSV阳性样品,阳性率为45.4%。ORF5序列分析和系统进化树分析结果表明,本试验所获得的36株PRRSV毒株序列均属于北美型,与GenBank中高致病性PRRSV（HP-PRRSV）参考毒株的氨基酸同源性为94.6%-100%,并可分为5个亚群,亚群III与HP-PRRSV同源性最高,几乎所有的亚群中和表位（primary neutralizing epitope,PNE）都存在变异,亚群III和IV相对于其它亚群具有更多的糖基化位点。由于36个毒株是于2008-2010年间采集自安徽、江苏、上海等7省,进化树分析结果表明,病毒的分型并没有呈现明显的地域性。【结论】2008-2010年间中国华东地区普遍存在PRRSV感染,PRRSV流行株为HP-PRRSV,其遗传演化相对稳定,但也具有不同的遗传特征。来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉,虽然亚群IV和V只出现在部分省市,但PRRSV的分布没有呈现明显的地域特征。     

断奶仔猪多系统衰竭综合征相关病原混合感染的流行病学调查

为了解中国江苏省及周边地区猪场断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相关病原的流行情况,本研究采用PCR方法,对2014年1月至2015年5月采自江苏、安徽及浙江等地猪场的125份健康猪样品和261份发病猪样品分别进行猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、输血性传播病毒(TTV)和类猪圆环病毒P1的检测。结果显示,所有样品PCV2、PRRSV、PPV、TTV1、TTV2和P1的阳性率分别为39.38%、21.76%、3.11%、15.80%、16.32%和10.10%,其中混合感染主要存在于PMWS的发病猪群,以PCV2与TTV2 (15.32%)和PCV2与PRRSV (11.87%)的混合感染为主。结果表明,江苏省及周边地区猪场普遍存在PMWS相关病原的混合感染现象,加大了PMWS相关病原的防控难度。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究#br#

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

猪瘟病毒阳性血清的猪瘟抗体检测与分析

为掌握猪瘟病毒阳性血清的猪瘟抗体水平分布情况,应用美国IDEXX公司的猪瘟病毒抗体检测试剂盒对江苏省农业科学院动物疫病诊断检测中心临床门诊近期收集的经PCR检测为猪瘟病毒阳性的26份血清进行猪瘟抗体水平的检测,以期为猪场猪瘟的有效防控提供科学数据参考。结果显示:猪瘟抗体阳性率为26.9%,阴性率为57.7%,可疑率为15.4%,抗体阻断率平均值为28.0%,且78.6%的猪瘟抗体阴性血清阻断率小于10%,即不同猪瘟抗体水平的血清均可检出猪瘟病毒,但猪瘟抗体阻断率小于10%的血清所占比例最大,达42.3%。因此,猪场在日常的猪瘟抗体检测中,如果发现猪瘟抗体阻断率小于10%的猪只所占比例越大,则预示着猪群中猪瘟带毒的比例越高。     

某规模化猪场猪瘟抗体水平的跟踪监测与应用

应用美国IDEXX公司的猪瘟病毒抗体检测试剂盒对某规模猪场的36头断奶母猪在猪瘟疫苗免疫前、免疫后30 d及部分抗体不合格猪加强免疫后30 d的血清样品进行猪瘟抗体的跟踪监测,以对生产母猪的抗体水平和免疫状态进行分析和评估。结果显示,91.7%的断奶母猪在疫苗免疫后抗体水平会有一定幅度的上升,且阻断率低于45%的母猪免疫后增幅较大,阻断率高于70%的母猪免疫后增幅不明显。随后对免疫后抗体仍为阴性的母猪进行猪瘟疫苗的加强免疫,并在加强免疫后30 d进行采血检测,结果表明,对该部分母猪即使进行猪瘟疫苗的加强免疫,抗体水平仍未能上升。由于在猪场实际生产中检测抗体比检测病毒容易,所以可以只进行抗体检测,淘汰无抗体反应或抗体水平异常低下的种猪,对于种猪群的净化、提高种猪群抗体水平的整齐度和规避仔猪发生免疫失败等方面具有重要意义。     

猪链球菌2型HA0609的分离及致病性研究

从江苏省某屠宰场猪的扁桃体中分离到1株细菌,通过培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、生化试验以及荚膜多糖(cps)基因的PCR检测,确定为猪链球菌2型,命名为HA0609。本试验针对猪链球菌7种主要毒力因子——谷氨酸脱氢酶(gdh)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)、次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(impdh)及毒力相关序列orf2,进行PCR检测。与已知强毒株比较,该菌株2种主要毒力因子sly和epf均为阴性。动物试验显示HA0609对猪、兔和Balb/c鼠均无致病性。