出血性大肠杆菌O157: H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶ H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势.构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右.重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA.二免后攻击50LD50的EHEC O157∶ H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短.结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHEC O157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值.     

类猪圆环病毒因子P1在自然感染仔猪体内的组织分布

选用3头自然感染仔猪和1头阴性对照猪,剖杀后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、脑、空肠、扁桃体、胸腺、淋巴结、膀胱、性腺等组织,用荧光定量PCR方法检测病毒在组织中的分布及病毒载量.结果显示,类猪圆环病毒因子P1分布在仔猪的心脏、肝脏、肺脏、胰脏、脑和膀胱等组织,病毒载量以胰脏、脑和膀胱为最高,可达105拷贝/g以上；对照猪脏器中没有检测到病毒核酸.该研究为P1的诊断及致病机制奠定了基础.     

猪伪狂犬病的净化策略

鉴于2012年后猪伪狂犬病在国内的流行呈逐年上升的趋势,其是引起目前生长猪群发生呼吸道疾病综合征和母猪发生流产的主要病原,1986年Vanoirschot首先建立了针对g E的阻断ELISA方法,该方法自建立起,已经在全世界得到了广泛应用,且过去几十年,世界上一些主要伪狂犬病流行国家相继启动了根除计划并已取得了成功。目前猪伪狂犬病的净化已被列入国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)。江苏省农业科学院动物疫病诊断检测中心在借鉴国外伪狂犬病净化成功经验的基础上,进行了江苏省目前养猪条件下种猪场猪伪狂犬病净化策略的研究,通过一年多的实践发现"免疫→检测→淘汰→补充阴性后备猪→免疫→检测→淘汰"的净化措施是切实可行的,江苏省的2家规模种猪场在实施猪伪狂犬病的根除计划后已取得了一定成效,具有推广价值。     

一例因外购仔猪暴发猪瘟引起的思考

某猪场发生一起外购仔猪暴发猪瘟的病例,经调查发现此猪场周边猪场时有猪丹毒病例的发生,猪场老板遂将此次外购的80头体重25~35 kg的仔猪随机等分为A组和B组,对A组免疫猪瘟单苗,对B组免疫猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗,以期对2组猪的免疫效果进行比较。免疫后13 d,B组猪只陆续发病,A组猪只正常,经过对B组2头送检发病仔猪的PCR检测,该病例被确诊为猪瘟病毒感染,虽然对B组仔猪进行了猪瘟疫苗的紧急免疫,但是仍未能有效控制死亡。     

断奶仔猪多系统衰竭综合征相关病原混合感染的流行病学调查

为了解中国江苏省及周边地区猪场断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)相关病原的流行情况,本研究采用PCR方法,对2014年1月至2015年5月采自江苏、安徽及浙江等地猪场的125份健康猪样品和261份发病猪样品分别进行猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、输血性传播病毒(TTV)和类猪圆环病毒P1的检测。结果显示,所有样品PCV2、PRRSV、PPV、TTV1、TTV2和P1的阳性率分别为39.38%、21.76%、3.11%、15.80%、16.32%和10.10%,其中混合感染主要存在于PMWS的发病猪群,以PCV2与TTV2 (15.32%)和PCV2与PRRSV (11.87%)的混合感染为主。结果表明,江苏省及周边地区猪场普遍存在PMWS相关病原的混合感染现象,加大了PMWS相关病原的防控难度。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白部分片段的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体间接ELISA检测方法,该研究首先克隆了MRP编码基因的部分片段,构建了重组表达质粒pET28a-mrp,并将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,获得了58 000的重组蛋白,经Ni柱纯化后,免疫印迹显示MRP重组蛋白能够被猪链球菌2型抗体特异性识别。以纯化的MRP重组蛋白作为包被抗原,建立了猪链球菌2型MRP抗体检测间接ELISA方法。该ELISA方法的包被抗原浓度为10μg/ml,待检血清1∶50稀释,检测临床48份未免疫猪链球菌2型疫苗健康猪的血清。当效价(S/P)≥0.22时,判定待检血清样品为阳性;当S/P<0.22时,判定待检血清样品为阴性。运用建立的方法能特异性识别猪链球菌2型抗体,人工感染猪的MRP抗体于攻毒后14～28 d出现峰值,同时提示临床健康猪群的免疫功能存在个体差异。     

猪瘟病毒阳性血清的猪瘟抗体检测与分析

为掌握猪瘟病毒阳性血清的猪瘟抗体水平分布情况,应用美国IDEXX公司的猪瘟病毒抗体检测试剂盒对江苏省农业科学院动物疫病诊断检测中心临床门诊近期收集的经PCR检测为猪瘟病毒阳性的26份血清进行猪瘟抗体水平的检测,以期为猪场猪瘟的有效防控提供科学数据参考。结果显示:猪瘟抗体阳性率为26.9%,阴性率为57.7%,可疑率为15.4%,抗体阻断率平均值为28.0%,且78.6%的猪瘟抗体阴性血清阻断率小于10%,即不同猪瘟抗体水平的血清均可检出猪瘟病毒,但猪瘟抗体阻断率小于10%的血清所占比例最大,达42.3%。因此,猪场在日常的猪瘟抗体检测中,如果发现猪瘟抗体阻断率小于10%的猪只所占比例越大,则预示着猪群中猪瘟带毒的比例越高。     

某规模化猪场猪瘟抗体水平的跟踪监测与应用

应用美国IDEXX公司的猪瘟病毒抗体检测试剂盒对某规模猪场的36头断奶母猪在猪瘟疫苗免疫前、免疫后30 d及部分抗体不合格猪加强免疫后30 d的血清样品进行猪瘟抗体的跟踪监测,以对生产母猪的抗体水平和免疫状态进行分析和评估。结果显示,91.7%的断奶母猪在疫苗免疫后抗体水平会有一定幅度的上升,且阻断率低于45%的母猪免疫后增幅较大,阻断率高于70%的母猪免疫后增幅不明显。随后对免疫后抗体仍为阴性的母猪进行猪瘟疫苗的加强免疫,并在加强免疫后30 d进行采血检测,结果表明,对该部分母猪即使进行猪瘟疫苗的加强免疫,抗体水平仍未能上升。由于在猪场实际生产中检测抗体比检测病毒容易,所以可以只进行抗体检测,淘汰无抗体反应或抗体水平异常低下的种猪,对于种猪群的净化、提高种猪群抗体水平的整齐度和规避仔猪发生免疫失败等方面具有重要意义。     

猪链球菌2型HA0609的分离及致病性研究

从江苏省某屠宰场猪的扁桃体中分离到1株细菌,通过培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、生化试验以及荚膜多糖(cps)基因的PCR检测,确定为猪链球菌2型,命名为HA0609。本试验针对猪链球菌7种主要毒力因子——谷氨酸脱氢酶(gdh)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)、次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(impdh)及毒力相关序列orf2,进行PCR检测。与已知强毒株比较,该菌株2种主要毒力因子sly和epf均为阴性。动物试验显示HA0609对猪、兔和Balb/c鼠均无致病性。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究#br#

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。