猪抗病毒蛋白基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立

根据GenBank中的猪抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了PKR、OAS/RNase L及Mx的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx标准曲线及其直线回归方程;该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点;建立的荧光定量PCR方法可检测抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx mRNA水平。为猪体内抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx的mRNA水平的定量检测提供必要的技术。     

中国猪群存在Torque teno Virus(TTV)感染

为了探讨中国猪群TTV的感染现状以及是否存在新的基因亚型,基于TTV1和TTV2相对保守的5′非翻译区(5′UTR)设计引物,采用PCR法对2008~2009年采集于中国江苏省的138份猪血清进行了检测。结果表明,中国猪群TTV1的感染率为15.9%,TTV2的为34.8%,共感染率为5.8%。所扩增片断的核苷酸序列分析结果表明,中国TTV1和TTV2流行毒株之间的核苷酸同源性分别为87.3%~93.8%和74.8%~99.1%,与GenBank其他TTV1和TTV2毒株的同源性分别为69.6%~100.0%和74.8%~99.1%。系统进化分析结果表明,中国TTV1和TTV2流行毒株存在新的基因亚型。     

猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用

根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的核酸进行扩增,均无PCV3目的条带出现;随机抽取扩增的16份临床病猪样品目的条带进行TA克隆后测序,结果显示均为PCV3特异性目的片段,16株PCV3江苏毒株扩增序列与已报道的PCV3/US/SD2016和PCV3/CN/Hubei-618基因序列同源性分别为98.4%~99.6%、99.0%~99.8%,而16个毒株之间的同源性为98.3%~100%。利用所建立的PCR方法检测了2014~2017年间收集的江苏省临床病猪样品938份、健康猪样品500份,PCV3的阳性检出率分别为6.93%和0.6%;其中,2014年病猪样品中的阳性率为1.92%,后呈逐渐上升的趋势,2017年达到12.67%。本研究表明,建立的PCR方法特异、敏感,可以用于临床PCV3的检测;PCV3在江苏省猪群2014年已有感染,并呈逐年升高的趋势,应予以重视。     

一起断奶仔猪副伤寒与圆环病毒病混合感染的成功诊治

2014年11月江苏省南京市周边某规模化猪场发生一起仔猪断奶后急性死亡的病例,通过对发病仔猪进行分子生物学诊断和细菌的分离鉴定,最终确诊为仔猪副伤寒与圆环病毒病混合感染。通过采取提高保育舍的栋舍温度,选用敏感药物对症治疗及对14日龄的产房仔猪增加圆环病毒病疫苗免疫等措施后,成功控制了病情,后续的断奶仔猪再无新发病例。研究分析了该猪场本次发病的原因及分离菌株对猪场常用抗生素的耐药特性,为仔猪副伤寒与圆环病毒病混合感染的诊治提供了科学依据。     

高致病性猪蓝耳病与猪链球菌2型混合感染的诊断与防控

高致病性猪蓝耳病(HP-PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株引起的一种猪的高度接触性传染病,可造成母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状,具有发病急、传播快、发病率高和病程长等特点.夏秋季多发,隐性带毒猪和发病猪是该病的重要传染源.高致病性猪蓝耳病易引起猪群的免疫抑制,继发或混合感染其他病原.猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的不同临诊类型的传染病的总称,根据其荚膜抗原(CPS)的不同,分为35种血清型,主要以血清2、7、9型居多,其中2型致病力最高.     

猪圆环病毒2型Rep蛋白基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

采用PCR方法扩增猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白基因,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE检测目的蛋白得到成功表达,采用His标签单抗和PCV-2阳性猪血清进行Western blot鉴定表明重组蛋白具有良好的抗原性.利用纯化的重组蛋白rRep作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法.抗原最适包被质量浓度为1 mg/L(0.1 μg/孔),待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶3 000.用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清,结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为＜5％和＜10％,表明本方法具有较好的特异性和重复性.应用rRep-ELISA对113份血清样品进行检测,与rCap-ELISA结果比较,rRep-ELISA检测阳性率为50.44％(57/113),略低于后者的54.87％(62/113),2种方法检测符合率为88.5％(100/113),具有较好的一致性.这为PCV-2感染的流行病学调查和新型ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础.     

猪源马链球菌兽疫亚种类M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。     

一例因外购仔猪暴发猪瘟引起的思考

某猪场发生一起外购仔猪暴发猪瘟的病例,经调查发现此猪场周边猪场时有猪丹毒病例的发生,猪场老板遂将此次外购的80头体重25~35 kg的仔猪随机等分为A组和B组,对A组免疫猪瘟单苗,对B组免疫猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗,以期对2组猪的免疫效果进行比较。免疫后13 d,B组猪只陆续发病,A组猪只正常,经过对B组2头送检发病仔猪的PCR检测,该病例被确诊为猪瘟病毒感染,虽然对B组仔猪进行了猪瘟疫苗的紧急免疫,但是仍未能有效控制死亡。     

出血性大肠杆菌O157: H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶ H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势.构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右.重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA.二免后攻击50LD50的EHEC O157∶ H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短.结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHEC O157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值.     

类猪圆环病毒因子P1在自然感染仔猪体内的组织分布

选用3头自然感染仔猪和1头阴性对照猪,剖杀后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、脑、空肠、扁桃体、胸腺、淋巴结、膀胱、性腺等组织,用荧光定量PCR方法检测病毒在组织中的分布及病毒载量.结果显示,类猪圆环病毒因子P1分布在仔猪的心脏、肝脏、肺脏、胰脏、脑和膀胱等组织,病毒载量以胰脏、脑和膀胱为最高,可达105拷贝/g以上；对照猪脏器中没有检测到病毒核酸.该研究为P1的诊断及致病机制奠定了基础.