BOX-PCR技术在细菌遗传多样性研究中的应用

以BOX片段(细菌基因组重复序列)为基础的原核生物DNA指纹图谱技术,具有操作简单快捷,可重复性强,容易获得较为丰富的扩增条带等特点。作者综述了BOX-PCR指纹图谱分析技术的特点和一般步骤,并对该技术在细菌菌株遗传多样性研究领域的应用现状和前景进行了阐述。     

牛支原体检测方法研究进展

随着规模化养牛业的不断发展,牛支原体已经成为危害养牛业的一种重要致病性支原体。本文介绍了牛支原体病原学、血清学及分子生物学方面实验室检测方法的研究进展,为我国牛支原体病的防治提供了参考。     

Ⅰ亚群禽腺病毒通用PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、特异、敏感的Ⅰ亚群禽腺病毒(FADV-Ⅰ)临床通用PCR检测方法,本研究根据Gen Bank登录的FADV-Ⅰ不同血清型基因组序列,比对分析后选择病毒DNA聚合酶基因设计通用检测引物,优化PCR体系各反应条件,确定该方法的敏感性与特异性,建立了检测FADV-Ⅰ通用PCR方法,并将其进行了临床应用与感染SPF鸡脏器组织病毒分布检测比较。结果显示,经优化确定引物浓度为1.0μM,退火温度为50.4℃～61.0℃,该方法能够特异性扩增该亚群病毒494 bp的DNA聚合酶基因,对产蛋下降综合征病毒、马立克病毒、鸡痘病毒等扩增结果均为阴性,特异性强;该方法的检测限为2.8×102拷贝/μL病毒PCR产物标准品;对临床病例经PCR检测、病毒血清型鉴定与分离结果显示,该方法与病毒分离方法符合率达100%,且检测的病毒被鉴定为4、8a、8b和11血清型FADV;对病毒感染鸡脏器组织检测结果显示,该方法对其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃与肌肉样品均可以检测到该病毒,较文献报道方法更敏感。以上结果表明本研究建立的PCR检测方法具有通用、特异、敏感、快速、准确等特点,能够用于FADV-Ⅰ的临床检测,为防控该亚群FADV引发的疫病提供了技术保障。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SDZP P126株GP2基因序列分析及其对病毒增殖的影响

旨在研究1株连续传代的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) SDZP P126 GP2基因的变异情况,以及GP2对病毒增殖的影响。构建GP2基因全长真核载体pEGFP-N1-GP2,利用生物学软件对GP2基因进行核苷酸和氨基酸的同源性分析,并将重组质粒pEGFP-N1-GP2转染到Marc-145细胞上,接毒后检测对病毒增殖的影响。通过GP2基因核苷酸和氨基酸的同源性分析,发现9个碱基的突变,这9个碱基的突变导致了5个氨基酸的突变。其中氨基酸序列中的第10位由亮氨酸突变为苯丙氨酸,这一突变在多株致弱毒株中存在,在Marc-145细胞转染重组质粒pEGFP-N1-GP2对病毒的增殖无显著影响。初步推断SDZP P126 GP2基因的突变对病毒在Marc-145细胞上增殖没有影响。     

禽蛋的贮藏与加工

禽蛋是人民日常生活中重要的副食品，含有人体所需要的各种营养成分，其中蛋白质含量在12％以上，脂肪含量在11％以上，而且消化利用率很高。鲜蛋经过加工，可以制成各种蛋制品和美味佳肴。例如，用鸭蛋或鸡蛋可以加工成鲜美可口的松花蛋、成蛋等，也可以用鲜蛋加工成冰蛋、蛋粉等制品，作为食品加工的重要原料。     

禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2蛋白表达、纯化及其间接ELISA方法建立

PCR扩增irp2主要抗原表位区,构建pET-32α-irp2表达载体,转化BL21(DM3)细胞诱导表达。以纯化irp2蛋白为抗原建立ELISA检测方法,确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液与封闭条件和临界值等参数,进行ELISA性能检测及应用。结果显示,PCR扩增出约519bp特异性irp2主要抗原表位基因,经菌液PCR、双酶切及DNA测序显示成功构建pET-32α-irp2表达载体。irp2目的蛋白获得有效表达,相对分子质量大小约34 500,亲和纯化后纯度达90%以上。Western blot显示目的蛋白irp2与抗血清在约34 500出现特异性显示条带。确定ELISA抗原包被质量浓度3.25mg/L、血清稀释度1∶80,封闭液为5%脱脂奶粉,封闭条件37℃1h+4℃10h,临界值为0.320。性能检测显示,其敏感性可达1∶5 120;与鸡白痢沙门菌、鸡传染性鼻炎、鸡霉形体、鸡巴氏杆菌、HPI-大肠杆菌等血清无交叉反应特异性,批内、批间变异系数分别为3.40%~6.71%和5.20%~8.44%;与PCR方法对124份血清平行试验其符合率93.8%;对1 425份临床血清样品irp2抗体阳性检出率37.4%。结果表明,建立了可检测血清中irp2蛋白抗体的间接ELISA方法,适用于临床血清样品进行快速抗体检测,为HPI大肠杆菌的流行病学调查和致病性大肠杆菌免疫机制研究奠定基础。     

兔出血症病毒次要衣壳蛋白VP12在大肠杆菌体内高效表达及特性研究

试验旨在通过原核高效表达RHDV VP12蛋白,检测同源组织疫苗免疫后该蛋白抗体的产生情况。RT-PCR扩增获得抗原遗传变异株SQ-1株兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)次要衣壳蛋白VP12基因,定向克隆插入pET32a多克隆位点,构建Trx-His tag融合原核表达载体,PCR与序列测定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Western blot鉴定分析表达产物活性。测序结果显示,所扩增VP12基因ORF(开放阅读框)为354 bp,编码117个氨基酸,IPTG诱导后目的基因获得表达,融合载体Trx-His tag的重组VP12蛋白分子量为31 ku,与预期一致,且表达蛋白存在可溶性与包涵体两种形式;Western blot结果显示,可溶性表达蛋白与兔瘟肝组织灭活疫苗免疫后攻毒制备的RHDV阳性抗体能发生良好的抗原抗体杂交反应,说明该蛋白具有良好的反应原性。研究结果为开展RHDV VP12蛋白生物学与免疫学特性研究、开发诊断试剂奠定了基础。     

兔病毒性出血症的诊治

兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）又称兔瘟．是由兔病毒性出血症病毒引起的一种急性、烈性传染病，易感兔发病率、死亡率高达40％-90％。该病自1984年首次在我国江苏省发现以来，国内外均有相关的报道．该病的发生和蔓延给世界养兔业造成了巨大的损失。     

山东首例牛支原体病的诊治报告

近年来,山东省常发生类似牛传染性胸膜肺炎症状的疾病。通过病料的采集、支原体分离、生化鉴定、PCR检测、16SRNA序列分析及临床治疗等研究工作,证实成功分离到一株牛支原体,且能够形成典型的煎蛋状的菌落;分子生物学检测进一步确定为牛支原体,临床上使用疫苗和敏感药物,能够迅速控制疫情的发生。这是牛支原体病在山东省的首次发病报道,有利于下一步该病科学防控。     

一株血清型为034的鸡源大肠杆菌的分离鉴定

鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏杆菌（Escherichiacoli,E．coli）某些血清型菌株引起的一类疾病的总称。临床可以引起胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、全眼球炎、气囊病、腹膜炎、输卵管炎、心包炎、肠炎、滑膜炎型等一系列病症,是危害养禽业健康发展的主要疫病之一。大肠杆菌抗原主要有O抗原、K抗原、H抗原和F抗原等,目前已知有O抗原173种,K抗原103种,H抗原60种,F抗原也陆续被鉴定中,这些抗原可组合成不同的血清型。在国内,其血清型呈地区性和多样性分布,且由于不同血清型之间交叉免疫保护率较低,对该病的免疫防控工作提出了很大的挑战。