鹅呼肠孤病毒GRV1株分离鉴定及其σC基因特征性分析

从患运动障碍的雏鹅肝脏和脾脏分离到一株鹅源呼肠孤病毒,该病毒经琼脂扩试验可与番鸭呼肠孤病毒(MuscovyDuckReovirus,MDRV)的抗血清发生交叉反应,推测其为呼肠孤病毒,命名为GRV1。参考GenBank禽呼肠孤病毒(AvianReovirus,ARV)和番鸭呼肠孤病毒小外壳蛋白(minorcoreprotein)σC蛋白基因序列设计合成了一对引物,病毒RNA经RT-PCR扩增,产物为810bp,与预期的目的片断大小一致,测序结果表明σC基因在280～1089区间是一个开放性阅读框架,编码269个氨基酸的蛋白,GC含量为49.88%,等电点为6.497,分子量为29.4Ku。核苷酸序列经DNAStar(6.0)软件分析,与法国番鸭呼肠孤病毒89026株核苷酸同源率为93.0%,与鸡呼肠孤病毒σC基因同源率仅为21%～25%,同源性分析表明鹅呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤病毒可能来自同一祖先,建议将鹅呼肠孤病毒连同番鸭呼肠孤病毒归属为正呼肠孤病毒属第二个亚群中不同于禽和内尔森贝海湾呼肠病毒的独立基因群。由蛋白质分析软件Anthepro5.0和MultiCoil软件分析表明,抗原区多位于N末端,没有跨膜区,σC为三股螺旋结构,这是我国第一次在鹅体内分离到呼肠孤病毒,同时也是第一次在数据库中提供σC的序列。     

鸭新城疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立

为了对目前流行的鸭新城疫进行快速诊断,应用蔗糖密度梯度离心纯化后的鸭新城疫病毒免疫6周龄雌性Balb/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次亚克隆后获得一株能稳定分泌鸭新城疫病毒特异性单克隆抗体的细胞株2C1.以PEG纯化后的2C1腹水为捕获抗体,辛酸-硫酸铵纯化的兔抗鸭新城疫病毒多克隆抗体为第二抗体,HRP标记的羊抗兔抗体作为酶标抗体,建立了检测鸭新城疫病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法.结果表明,当2C1包被量为4μg/孔,鸭新城疫病毒1:10稀释,兔抗鸭新城疫病毒多抗作用量为0.1 μg/孔,HRP标记的羊抗兔二抗1:10 000倍稀释,每次作用时间为1h时,P/N比值最高,且阳性OD值最接近1.0.试验表明,该方法特异性好,不与IBV、ARV、GPV、DPV、DHV尿囊液及H5、H9标准阳性抗原发生反应;可以检测出0.2 μg纯化病毒,比传统的HA试验的敏感性至少高64倍;批间和批内变异系数均小于10％.本研究建立的双抗体夹心ELISA方法为鸭新城疫病毒的快速诊断奠定了基础.     

猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物的制备

以非离子去污剂Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，与新型佐剂ISCOM基质作用，应用离心和透析相结合的方法制备了猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物（PRV－ISCOMs）。PRV－ISCOMs经磷钨酸负染后电镜观察见到囊膜蛋白分布在ISCOM颗粒表面，形成直径30－40nm的笼格状结构，同时将PRV－ISCOMs在－20℃冻融5次后经电镜观察仍见到典型的笼格状结构，与国外报道的形态一致，本结果证实我们成功地制备了具有良好稳定性的PRV－IS－COMs。     

影响佐剂应用的因素

佐剂能够增强疫苗的免疫效果,已经在多种疫苗研究中使用佐剂。但在生产过程中,佐剂的使用受到一定的限制。限制因素包括安全性,作用机理研究相对落后,免疫途径多样化,佐剂诱导不同的免疫应答类型,效果评价方法不统一,以及自身的物理化学性状的不稳定性等问题。     

鹅细小病毒弱毒株选育的研究

应用番鸭胚成纤维细胞（MDEFC）培育出适应MDEFC增殖并产生细胞病变的鹅细小病毒弱毒疫苗株，同时测定了该弱毒株的部分生物米特性。结果显示：该弱毒株已失去对1日龄雏番鸭的致病性，在雏番鸭体内连续肓传5代，未见毒力反强现象；该弱毒株对MDEFC的TCID50稳定在10^-5-10^-6/0.1ml；1日龄雏番鸭免疫接种后7天攻毒可获100％保护，表明该弱毒株安全、免疫原性良好。     

番鸭呼肠孤病毒非结构基因的克隆和序列分析

参考GenBank禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus,ARV)和番鸭呼肠孤病毒(Muscovy Duck Reovirus,MDRV)非结构基因(NS)序列设计合成一对引物,对番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因进行RT-PCR扩增,克隆到pMD18-T载体中,并对克隆产物进行酶切鉴定和测序;番鸭呼肠孤病毒NS基因由1 291 bp核苷酸组成,与禽呼肠孤病毒NS基因相比,在非编码区第1155位少一个碱基,本文第一次证实1291bp是番鸭呼肠孤病毒NS基因特有的长度;番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因的5'末端和3'末端分别为5‘GCTTTT和TCATC-3',是禽类呼肠孤病毒基因末端特有的碱基序列,S14和C4株NS基因的的有效阅读框(24～1127bp)编码367个氨基酸组成的蛋白,分子量约为40kDa;番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS蛋白等电点分别是7.3和7.0,GC含量分别为54.26%和53.71%,番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因间核苷酸同源性为99.3%,仅有4个氨基酸差异,S14和C4与法国番鸭呼肠孤病毒89026株NS基因核苷酸同源性分别为87.8%和87.9%,与鸡关节炎病毒S1133 NS基因同源性分别为79.0%和79.3%;进化树分析表明本研究中的两株番鸭呼肠孤病毒非结构基因(NS)与番鸭呼肠孤病毒的亲缘关系比禽呼肠孤病毒近的多,建议番鸭呼肠孤病毒应归属为正呼肠孤病毒属第二个亚群中不同于禽和内尔森贝海湾呼肠病毒独立基因群.     

番鸭呼肠病毒活疫苗免疫途径及其效果研究

1日龄雏番鸭经肌肉注射、口服、点眼 和喷雾等途径免疫番鸭呼肠病毒活疫苗, 7d后攻毒。结果表明,肌肉注射免疫组保护 率为100%,口服免疫组保护率为85.7%,点 眼组保护率为0%,喷雾组保护率为0%;血液 淋巴细胞转化能力测定结果显示肌肉注射免 疫组淋巴细胞活性最高,口服免疫组次之,点 眼组、喷雾组最差。与对照组相比,35d后无 显著差异,与攻毒保护结果类似。番鸭呼肠病 毒活疫苗以肌肉注射免疫效果最好,口服免疫 也能提供有效保护,但点眼和喷雾途径不能提 供有效保护;口服免疫有望成为比肌肉免疫更 安全、方便、快捷的免疫途径。     

鹅细小病毒诊断与防治的研究进展

鹅细小病毒病或称小鹅瘟(GooseParvovirus,GPV),是由鹅细小病毒引起的雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性败血性传染病。该病于1956年由方定一教授首次在江苏扬州发现。20世纪60年代中后期,在亚洲、欧洲、美洲等国家相继报道该病的发生与流行。该病主要侵害3～20日龄的雏鹅,也感染雏番鸭,传播快,发病率和死亡率较高,特征表现为水样腹泻,渗出性肠炎,乃至腊肠样栓塞。     

番鸭呼肠孤病毒弱毒株选育研究

应用番鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)交替传代选育出适应CEF繁殖的番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗株。该弱毒株已失去对1日龄雏番鸭的致病性,对CEF的TCID50稳定在10-5~10-5.5;在雏番鸭体内连续盲传5代,未见毒力返强现象;1日龄雏番鸭免疫不同代次弱毒后7 d攻击番鸭呼肠孤病毒强毒,保护率均在88%以上,且不同代次弱毒的外源病毒检验结果均为阴性。上述结果表明该弱毒株无外源病毒污染、安全性好、遗传性稳定、免疫原性强,可用于制备番鸭呼肠孤病毒病活疫苗。     

福建省部分养殖场鸡圆圈病毒3型病原检测及VP2基因分析

为了解福建省鸡场圆圈病毒3型（GyV3）的流行及其VP2基因变异情况,2021年在南平市、龙岩市和福州市的36个鸡场,采集365份疑似GyV3感染病鸡的腺胃样品,通过PCR进行GyV3核酸检测。结果显示：共检出GyV3核酸阳性55份,阳性检出率为15.06%。对5份GyV3阳性样品进行VP2基因序列分析发现,5份样品的VP2基因核苷酸和推导氨基酸序列相似性分别为98.6%～99.9%和98.3%～100%,与参考株山东肉鸡分离株SDAU-1和巴西家鸡分离株核苷酸和推导氨基酸序列的相似性分别为98.3%～99.2%和97.5%～99.2%,均属于Group A分支中的GyV3小分支。结果表明：福建省鸡场存在GyV3流行;其VP2基因遗传序列稳定,可作为GyV3感染流行病学监测的首选基因。本研究为GyV3的后续研究提供了理论依据。