广西巴马小型猪IFN-Y基因的克隆和序列分析

将猪外周淋巴细胞进行体外培养,在刀豆球蛋白A(conA)刺激培养15h后,提取培养淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增广西巴马小型猪Y-干扰素(IFN-Y)基因,并克隆到PMD18-T载体上,进行测序。测序结果表明,扩增的cDNA全长558个碱基,包含501个碱基开放阅读框架,编码166个氨基酸,分子量为19．42ku。此cDNA与人、牛、山羊、马、狗和鼠的IFN-Y基因核苷酸比较,同源性分别为74．9％,86．5％,86．9％,81％,58．7％和63．3％,与其它猪种的IFN-Y基因核苷酸比较同源性为100％。     

二株广西猪繁殖与呼吸综合征流行毒M基因的克隆和序列分析

广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)所致.利用针对PRRSV的N基因的特异性引物P1和P2,通过RT-PCR技术对分别从广西贵港市(GXGG)和南宁市(GXNN)收集到的可疑病料进行检测,结果两份为阳性.合成针对M基因的引物M1和M2,分别扩增了GXGG和GXNN两株PRRSV的M基因,并进行克隆和测序,得到长582个核苷酸的目的基因片段.应用DNAStar序列分析软件对所测的两个广西毒株与国内外已发表的ATCC VR-2332、LV和CH-la毒株进行同源性比较.分析表明,GXGG与ATCC VR-2332、LV、CH-la的核苷酸同源性分别为95.6%、69.5%、97.7%;GXNN与ATCC VR-2332、LV、CH-la的核酸同源性分别为94.9%、69.5%、97.3%.对推定的氨基酸序列进行了比较,GXGG与ATCC VR-2332、LV、CH-la的氨基酸同源性分别为97.7%、80.5%、97.7%;GXNN与ATCC VR-2332、LV、CH-la的氨基酸同源性分别为98.3%、79.9%、97.1%.说明广西流行毒株与ATCC VR-2332和CH-la的同源性很高,而与LV毒株的同源性很低.从本研究构建的系统发育树分析,广西流行的PRRSV与ATCC VR-2332株的亲缘关系比较密切.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染的诊断

本实验对从南宁市郊县某养猪场送检的病猪进行了病理剖检及微生物学检查。病猪消瘦、皮肤苍白、腹股沟淋巴结肿大、肺出血等，运用建立的PCR方法检查病猪的淋巴结、肺、脾等器官组织，发现PCV—2和PRRSV均为阳性，从而证实PRRSV和PCV—2在猪体内的混合感染。     

应用RT-PCR技术快速诊断广西猪繁殖与呼吸综合征病毒研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的N基因序列设计了一对引物，建立诊断PRRSV的RT-PCR技术。对从广西不同地区10个猪场送检的24份病猪材料进行检测。有4个猪场的5份病料检出PRRSV，证实广西存在PRRSV感染。     

牛乳头瘤病毒基因1型广西GX01流行株全基因组克隆及序列分析

为了解牛乳头瘤病毒1型(bovine papillomavirus genotype 1,BPV-1)广西GX01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,同时了解该毒株引起宿主产生的病理组织学变化情况,本研究选取广西贺州市患病牛皮肤肿瘤样物制作石蜡切片后镜检观察,提取病料DNA,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR扩增以确定此病毒的基因型,根据GenBank中BPV参考株设计嵌套引物,对GX01株进行全基因组扩增、克隆测序及序列分析。病理组织学检查结果显示,可在病变部位发现表皮细胞增生、肿胀,角质过度及挖空细胞等乳头瘤病毒感染的特征性病变。序列分析结果表明,GX01株为BPV-1,其全基因组长为7 945bp,包含E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2 8个开放阅读框,符合BPV-1型基因组的结构特征;GX01与BPV-1参考株全基因组核苷酸序列同源性为98.6%~99.6%,与BPV-2型参考株(M20219.1)、BPV-13型参考株(JQ798171.1)同源性分别为86.9%和87.2%。GX01株为广西地区首次经检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为广西地区乃至全国的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异、疫源追溯及科学防控提供了基础数据。     

从母猪白细胞检出猪瘟病毒

本研究应用RT-PCR对广西不同地区的老母猪白细胞172份、猪流产胎儿与死胎162份、新生仔猪33份和120份健康猪扁桃体进行猪瘟病毒检测.检出母猪白细胞阳性2份、流产胎儿与死胎阳性12份,健康猪扁桃体阳性1份和新生仔猪阳性3份.对其中1份母猪白细胞阳性材料、1份健康猪扁桃体阳性材料和4份流产胎儿材料进行猪瘟病毒E2基因的测序分析.结果显示,来自母猪白细胞的GXXJBl与HCLV、Shi-men株的核苷酸同源性分别为96.9%和94.0%,推导的氨基酸同源性分别为95.9%和94.2%;与其他的广西毒株的核苷酸同源性为81.1%～99.5%,推导的氨基酸同源性为89.6%～99.2%.根据遗传进化树分析,样品GXXJBI属于基因Ⅰ群.     

钦北区强化农村家犬免疫促进狂犬病的防控

正狂犬病(Rabies)是由弹状病毒科的狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)侵入中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)引起的一种高度嗜神经性急性致死性人兽共患传染病,也称"恐水症",俗称"疯狗病",可导致包括人在内的几乎所有温血动物死亡。狂犬病呈世界性流行,WHO估计全球每年约5.9万人因该病死亡,其中95%人患狂犬病由疯狗咬伤引起[1]。亚洲每年有1 100万人被犬咬伤,中国是受该病危害最严     

广西狂犬病分子流行病学的研究

自2000年起从广西各地采集1563份犬脑、4份发病牛脑、1份发病猪脑和1份猫脑组织。通过对这些动物脑组织进行PCR检测及用小白鼠脑内接种试验分离出42株狂犬病毒株,并对N基因3’端455个核苷酸片段进行测序分析。根据核苷酸同源性及遗传进化树分析结果,广西狂犬病流行毒株可分成4个群。Ⅰ群有GX01、GX08、GX09、GX014、GX019、GX091、GX123、GX173、GX174、GX195、GX260、GX443、GX452、GXSIO、GX520、GXBS、GXSL、GXGG、GXLA、GXHX、GXGL、GXNniu、GXWXp共23株,它们的核苷酸同源性在97．6％-100％之间;Ⅱ群有Gx074、Gx219、GX304、GX441、GX442、GX496、GX0510、GXBX、GXBM、CXQZ共10株,它们的核苷酸同源性在98．5％-100％之间;Ⅲ群只有GXN119;Ⅳ群有G）（506、GXS08、GXS09、GX120、GXB03、GXeat、GX201、GX102共8株,它们的核苷酸同源性在99．1％-99．6％之间。进一步氨基酸变异分析得知,与兽用疫苗株E1LA比较,所有42个毒株的第58位氨基酸由P变为S,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群的34株共同发生了H26Y、C40S、S61N、V95L、G106D和P135S位点的变异,Ⅰ群发生了T90N和E110D、Ⅱ群发生了T42S的群特异性变异。氨基酸分析结果与核苷酸同源性、遗传进化树分析结果一致。各群毒株呈现明显的地域分布特征,Ⅰ群主要分布在桂东地区,Ⅱ群主要分布在桂西地区。Ⅳ群主要分布在桂南地区。     

广西狂犬病病毒L基因聚合酶活性部位的多态性分析

对广西流行狂犬病病毒的L基因聚合酶活性部位进行克隆和测序,并与国外固定毒株和类狂犬病毒株进行比较分析。结果显示,广西流行毒株之间的核苷酸和推定的氨基酸同源性较高,分别为88.7%~99.8%和96.5%~100%,与国外固定毒株的核苷酸和推定的氨基酸同源性分别为84.8%~87.5%和94.5%~99.0%,与类狂犬病病毒株的核苷酸和推定的氨基酸同源性分别为75.5%~79.2%和93.5%~97.0%;通过比较推定的氨基酸序列发现,第660位为广西Ⅱ群毒株的特异性变异I660V,第771位为广西Ⅰ群毒株的特异性变异S771A,第745位点广西毒株全部为精氨酸,而国外参考毒株为丝氨酸、亮氨酸或组氨酸;4个基序高度保守,基序A保持不变,基序B、C、D只有少数氨基酸发生变异,基序C中的核心序列GDNQ在各毒株中都不变。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（ESTcontig110和ESTcontig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。