山羊毛囊干细胞分离培养方法研究

分别采用组织块法和酶消化法分离培养山羊毛囊干细胞,并通过形态学观察、免疫组化染色以及克隆形成率来比较2种方法体外分离培养毛囊干细胞的效率。组织块法获得的细胞第1、3、7代K19阳性率分别为52.0%±1.62%6、8.4%±1.82%、72.0%±2.42%,integrin-β1分别为52.5%±2.12%、66.3%±1.98%、73.0%±2.16%,而消化法获得的细胞第1、3、7代K19阳性率分别为56.2%±3.12%、61.7%±1.17%、64.0%±3.02%,integrin-β1分别为56.0%±1.12%、63.0%±1.12%、68.0%±2.32%;组织块法获得的细胞第1、3、7代克隆形成率分别为18.4%±0.77%、31.3%±0.88%、44.7%±1.03%,而消化法获得细胞第1、3、7代克隆形成率为22.6%±2.30%、26.9%±0.86%、32.8%±1.05%;在同样培养条件下,组织块法获得的细胞可体外传19代,而消化法可传12代。结果表明两种方法均能分离得到毛囊干细胞并进行传代,但随着传代次数的增加,组织块法获得的细胞免疫组化染色阳性率、克隆形成率以及传代能力均显著高于酶消化法获得的细胞(P<0.01)。     

构建具有毛囊结构的组织工程皮肤及移植研究

旨在构建具有毛囊、汗腺等皮肤附属器官的组织工程皮肤,为人类毛发移植和受损皮肤修复的临床应用提供新的思路。试验以山羊毛囊干细胞和真皮细胞为种子细胞,以羊膜、Ⅰ型胶原为支架材料,进行组织工程皮肤的体外构建,并将组织工程皮肤移植到山羊体内(试验组,同时以羊膜代替组织工程皮肤进行移植作为对照组),观察和检测其对受损皮肤的修复效果。试验结果表明,人工构建的组织工程皮肤经体外培养25 d后,发现有毛囊结构形成;人工皮肤经扫描电镜观察,显示表皮细胞出现角质化;移植30、60、90 d后的瘢痕面积显示,试验组创面恢复平整,瘢痕面积极显著小于对照组(P0.01);移植270 d后,活体组织切片检测发现,试验组真、表皮结构已发生重建,可见分化明显的基底层、毛囊结构,而对照组为致密的结缔组织。综上表明,本研究首次以山羊毛囊干细胞和毛囊真皮细胞为种子细胞,成功构建了具有毛囊器官的组织工程皮肤。     

外源性rhCNTF抑制成人成肌细胞体外分化作用及其信号机制

为探讨成肌细胞体外分化的机理,采用免疫组织化学和Western blot等方法,分析重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)对成人成肌细胞体外分化的作用及其信号机制。结果表明:①rhCNTF可逆性抑制成人成肌细胞体外融合(P0.01);②rhCNTF显著增加成人成肌细胞分化期间的p130阳性"储备细胞"数量(P0.01);③Western blot分析显示,rhCNTF可诱导ERK1/2磷酸化激活、成肌分化特异标志myogenin和p21蛋白表达的抑制以及"储备细胞"特异性标志p130蛋白水平的增加。首次发现,外源性rhCNTF可通过ERK1/2信号通路的激活增加"储备细胞"数量,可逆性抑制成人成肌细胞的体外分化。为进一步开展rhC-NTF在成人骨骼肌损伤修复中的作用研究奠定了基础。     

无血清分离昆明系小鼠胚胎干细胞

以昆明系小鼠胚胎为研究材料,以丝裂霉素C处理的胎鼠成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）为饲养层,在胚胎干细胞（Embryonic stemcells,ESCs）培养液中添加血清替代物（Knockout serumreplacement,KSR）以替代胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）,并与添加FBS的培养液进行对比,研究了昆明系小鼠胚胎贴壁、ICM（Inner cell mass,ICM）集落形成以及ESCs分离的情况。结果表明,在添加KSR的培养液中,胚胎在培养3~5 d贴壁,胚胎贴壁率显著低于添加FBS的培养液;5~7 d形成ICM集落,集落未分化形态可维持2~3 d,培养10 d ICM集落仍可保持典型的未分化形态;ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率与添加FBS的培养液相比差异不显著（P〉0.05）,但2~5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS的培养液,其中有2株ESCs在添加KSR的培养液中传到7代;所分离细胞显示碱性磷酸酶染色强阳性,Oct-4、Nanog的免疫组化染色阳性,具有ESCs的特点。结论：在ESCs培养液中添加KSR比添加FBS更有利于维持ICM集落及ESCs的未分化状态。     

哺乳类动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展

交ＥＳ细胞分离与克隆技术和分子生物学技术相结合就可将新的遗传物质导入家畜的生殖腺细胞。通过囊胚注入胚胎干细胞产生嵌合体小鼠表明对胚胎干细胞进行遗传操作是对物生殖细胞进行遗传改造的有效方法之一。     

小鼠胎儿成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

对不同日龄小鼠胎儿的成纤维细胞及在不同细胞浓度下成纤维细胞体外培养生长状况和制备饲养层的差异,选择最佳条件。结果表明,分离培养不同日龄（１１ｄ、１４ｄ、１７ｄ）小鼠胎儿成纤维细胞,细胞生长状况无明显差异,由其制备的ＥＳ细胞饲养层生长状况亦无明显差异,成纤维细胞的培养以１&#215;１０＾６个／ｍｌ细胞浓度为好,达寺或过小都不利于细胞生长。     

不同添加物对分离昆明系小鼠胚胎干细胞的影响研究

本试验以昆明系小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素（10μg/mL）处理的MEF为饲养层,研究了在ESCs培养液中分别添加KSR、FBS、FBS+PD98059 (50 μmol/L)对昆明系小鼠胚胎贴壁、ICM集落形成及ESCs分离培养的影响。结果表明,在添加KSR的ESCs培养液中,胚胎贴壁率显著低于添加FBS的ESCs培养液（P＜0.05）,但ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率差异不显著（P>0.05）,2~5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS的ESCs培养液（P＜0.05）,2株ESCs被传到7代;在添加PD98059+FBS的ESCs培养液中,胚胎贴壁率、ICM集落形成率和1~5代ESCs集落出现率均显著低于添加KSR或FBS的ESCs培养液（P＜0.05）;用0.5 g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割,1~5代ESCs集落出现率显著高于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA（P＜0.05）。结论：在ESCs培养液中添加KSR,较添加FBS或FBS+PD98059更适合用于分离培养昆明系小鼠ESCs,用0.5g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割优于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA。     

人胎儿骨髓间充质干细胞分离培养与生物学特性

人胎儿骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的群体倍增次数(70～80次)是成体BMMSCs(30～40次)的2倍,分化能力优于成体干细胞.研究采取纵向剪开骨髓腔涮洗细胞法和全骨髓培养法分离2～3月龄流产胎儿BMMSCs,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)筛选基础培养液和血清浓度并制作生长曲线,流式细胞仪和免疫组织化学法鉴定细胞抗原标志,并通过核型分析和成瘤实验评估细胞的安全性.结果表明,沿长轴剪开骨髓腔涮洗细胞法是获得2～3月龄人流产胎儿四肢长骨骨髓的实用方法.在实验范围内α-MEM(minimum essential medium alpha medium) 20?S(fetal cattle serum)是体外培养2～3月龄流产胎儿BMMSCs的最佳体系.分离的第3代BMMSCs除表达成体BMMSCs表面抗原标志外还表达Oct4、SSEA3和SSEA4,第6、12和24代细胞在对数增长期的群体倍增时间分别为34、36和40h,且均为二倍体核型、不成瘤.这证明2～3月龄人流产胎儿BMMSCs可以成为人类组织工程和再生医学研究理想的种子细胞.     

卵母细胞和供核细胞对体细胞克隆的影响

克隆胚胎发育率太低和后代缺陷率高是克隆不能广泛应用于畜牧生产和生物医药的最大障碍.影响克隆效率的因素很多,过去20多年主要集中于改进和完善核移植程序方面.