某些因素对牛和小鼠类胚胎干细胞分离与培养的影响

以荷斯坦牛胚胎和小鼠胚胎为材料 ,研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离 ;在 ES细胞分离与克隆中 ,以 15 %～ 2 0 %犊牛血清为宜 ,在 DMEM(L)培养基中添加 0 .1μmol/LNa2 Se O3 0 .1mmol/Lβ-巯基乙醇 10 μg/L IGF 10 0 0 IU/m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;在TCM199、DMEM(高糖 )和 DMEM(低糖 ) 3种培养基中 ,低糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离 ;优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在 37℃用低浓度消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 ,ES细胞克隆效率最高。     

山羊表皮干细胞的分离培养及EGFP基因转染研究

采用组织块法和酶消化法对山羊表皮干细胞进行分离,对分离的表皮干细胞进行了免疫组化染色鉴定,并对其进行了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染研究。结果表明,2种方法均能得到山羊表皮干细胞,其中组织块培养法简单易行,组织块可重复利用,但原代细胞脱出时间较长,平均为8 d,且培养季节对细胞脱出时间、原代传代时间、传代数有显著影响;酶消化法周期短,8 d左右即可传代,不同培养季节对细胞克隆形成时间、细胞传代时间和传代数无显著影响,但处理过程繁琐。EGFP基因在转染表皮干细胞24 h后大量表达,转染率达20%~30%,72 h时转染强度最大,荧光可持续5周;转染使细胞增殖能力明显下降。     

奶牛胚胎一步冷冻保存的研究

用ＦＳＨ－ＰＧＦ＿（２α）超排黑白花奶牛２２头，以非手术方法采得７～８日龄胚胎６８枚，其中４５枚胚胎用于一步冷冻试验。水浴解冻后共回收４０枚胚胎。用１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖一步除去保护剂，胚胎形态完好率为９０％（３６／４０）；荧光染色阳性率为８７．５％（７／８）；体外培养发育率为７５％（６／８）；冻胚移植受体妊娠率为４３．５％（１０／２３）。     

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后9．5－13．5d小鼠胎儿生殖峭／腺或其类似物及周围组织，采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞（EG细胞）系。即具有连续传代的能力（1例来自交配后11．5d胎儿类ES细胞传至10代），部分细胞集落呈典型鸟巢状结构，AP染色呈阳性，体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后7．5－8．5d和14．5－15．5d的小鼠胎儿，原代观察到类ES细胞集落，继代培养未观察到类ES细胞集落，16．5－18．5d小鼠胎儿原代培养未观察到ES样细胞集落。     

干细胞可塑性争议及分化假说

对有关干细胞可塑性的不同观点进行了概述,并关注了干细胞潜能和细胞表型多样性传统观点上的争议,讨论了在当前公认动物模型上观察到的干细胞可塑性现象,并对分化细胞发生细胞表型转变的试验性观察结果进行了总结。     

小鼠ES细胞在不同饲养层上培养nanog基因的 表达水平与生长行为

观察小鼠ES-D3细胞在MEF、新生牛睾丸支持细胞(nBTSCs)和新生兔睾丸支持细胞(nRTSCs)饲养层上生长4dnanog基因的表达水平和生长行为。RT-PCR分析显示,MEF饲养层上培养4d的ES-D3nanog基因含量高;nBTSC饲养层上培养nanog基因表达较低;而RTSC饲养层上培养nanog基因表达最低。结果显示:不同饲养层上的ES-D3细胞集落形态和培养4d分化程度有差异。在MEF饲养层上的ES-D3细胞培养4d,集落形态仍然很规则,细胞间紧密,集落表面少见大细胞,AKP染色强阳性。在nBTSC饲养层上的ES-D3细胞,集落界限清晰,AKP染色显示,集落大部分细胞呈阳性,少数的细胞集落为弱阳性,可见集落表面分散有较多的大细胞。在nRTSC饲养层上的饲养层上的ES-D3,集落隆起不明显,集落界限不清晰,大部分集落形态不太规则,AKP染色显示集落中部分细胞呈阳性,少数的细胞集落为全阴性,集落表面有较少的大细胞,集落周围有伸出的成纤维细胞。     

家兔板层角膜移植及效果观察

在普通手术条件下,对8只白色青年家兔(4只供体和4只受体)进行了板层角膜移植手术;在4只受体兔中,A兔和D兔采用连续缝合法,B兔和C兔采用间断缝合法。观察发现,4只受体兔均有抓挠眼部和互相舔眼现象;A兔在术后第6天突然死亡,但角膜植片完好,剖检见肠道出血;B兔和C兔分别在术后第6天和第8天角膜植片脱落,但无明显炎症反应;D兔到术后第15天时角膜完全透亮,整个缝线清晰可见,分辨不出植片边缘,第16天拆除缝合线。结果表明,兔角膜移植的术后护理很难,原因是他们不仅没有自我保护意识,反而有自我伤害行为;B兔和C兔的植片脱落与瞬膜摩擦、抓挠眼部和互相舔眼有很大关系。     

山羊核移植胚胎干细胞的分离培养

比较了不同发育阶段山羊核移植胚胎分离培养胚胎干细胞（NT-ESCs）的情况。结果表明,各阶段山羊核移植胚胎均可分离出NT-ESCs,其中孵化胚的NT-ESCs克隆形成率最高（38%）,与囊胚（26%）差异显著,与桑葚胚（18%）差异极显著。所分离的NT-ESCs细胞形态与正常ESCs相似,均具有碱性磷酸酶活性,可表达多能性基因Oct-4和表面标志抗原SSEA-1。     

仔猪胰腺干／祖细胞的生物学特性

分离1日龄长白仔猪的胰腺细胞后,通过显微镜和电镜观察细胞生长形态和超微结构,运用细胞计数法制作细胞生长曲线测定其群体倍增时间,采用免疫组化法测定细胞生长不同时期的表面标志蛋白的表达,用肝细胞因子和尼克酰胺联合诱导其向功能性G细胞分化,并测定了分化细胞对葡萄糖的反应能力。结果显示获得的仔猪胰腺祖／干细胞具有多种形态,以神经样细胞克隆生长占优势,电镜超微结构证实其具有核质比高、细胞器不分化的干细胞态特征。试验测得第1代和第3代群体的倍增时间分别为96．0、307．7h,仔猪胰腺祖／干细胞表达胚胎干细胞标志Oct4、SSEA-1、SSEA-4,也表达胰腺干细胞的标志PDX-1、CK7等。仔猪胰腺干／祖细胞的向β细胞诱导分化细胞对22mmol／L葡萄糖的刺激产生强烈的胰岛素分泌反应,胰岛素分泌量可达321．75mIU／L。结果证实仔猪胰腺千／祖细胞具有干细胞和胰腺祖的表面标志和超微结构,同时具有分化成分泌胰岛素β细胞的能力。