基于实时荧光定量PCR技术的猪伪狂犬病活疫苗含毒量评价

为定量分析贵州省临床用猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)活疫苗中病毒含量,根据GenBank中公布的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gB基因序列(登录号:M17321.1)设计1对特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,并对来自6个不同厂家的猪伪狂犬病活疫苗进行含毒量分析。结果显示,试验成功建立了可用于PRV检测的实时荧光定量PCR方法,标准曲线中标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值呈良好的线性关系,标准曲线方程为:Y=-0.97X+33.66(R^2=0.999),该方法最低检测病毒含量为3.19×10~1拷贝/μL,敏感性高且具有良好的重复性和特异性。应用所建立的实时荧光定量PCR方法对贵州省临床用6个厂家生产的猪伪狂犬病活疫苗的病毒含量进行检测,结果显示,6种市售猪伪狂犬病活疫苗(A～F)中病毒含量分别为1.67×10~7、4.83×10~5、2.64×10~6、4.27×10~7、3.39×10~6和3.68×10~5拷贝/μL,来自不同厂家的疫苗病毒含毒量存在明显差异,最大差异可达116倍,其中来自A、D厂家的两种猪伪狂犬病活疫苗具有较高的含毒量。本试验所建立的实时荧光定量PCR方法可用于猪伪狂犬病活疫苗病毒含量的快速检测和评价,对猪伪狂犬病活疫苗的质控和临床用疫苗选择具有一定的指导意义。     

BPV1贵州株L1基因序列分析及原核表达

为表达牛乳头瘤病毒1型贵州株(BPV1-GZLZ株)衣壳蛋白L1基因,采用PCR方法从贵州省六枝特区某规模化养牛场疑似病牛的皮肤肿瘤病料样品中扩增BPV1 L1基因,克隆至p MD19-T载体,测序后进行生物信息学分析;同时将BPV1-GZLZ株L1基因克隆于原核表达质粒p ColdⅠ中,经IPTG诱导L1蛋白表达,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting分析。生物信息学分析显示,BPV1-GZLZ株L1基因核苷酸序列长为1488 bp,编码495个氨基酸,分子结构式为C2484H3884N678O737S16,理论等电点(PI)为8.68,二级结构主要包括α-螺旋、无规则卷曲和β-折叠为主,无跨膜结构域和信号肽; BPV1-GZLZ L1基因序列与BPV1参考株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.8%,处在同一遗传进化分支,且与BPV13和BPV2、BPV2-GZ01的亲缘关系较近; Western blotting结果显示,经IPTG诱导的重组表达蛋白能与His单抗产生特异性反应,条带为55.6 kD左右与SDS-PAGE结果一致。研究表明,试验构建了BPV1-GZLZ株L1基因原核表达载体并成功表达。     

复合益生菌对早期断奶仔猪生长性能和体液免疫水平的影响研究

为研究枯草芽胞杆菌、酵母菌和乳酸菌三者组合的复合益生菌对早期断奶仔猪生长性能和体液免疫水平的影响,选取"杜×长×大"三元杂交断奶仔猪40头,分为对照组、试验A组、试验B组和试验C组,每组10头,试验A组、试验B组和试验C组与基础饲粮按质量比分别添加1.0‰、2.0‰和3.0‰复合益生菌,对照组不添加复合益生菌,以评价复合益生菌对早期断奶仔猪生长性能、免疫器官指数、血液生理指标和血清生化指标的影响。结果表明,试验B组和试验C组末重极显著高于试验A组和对照组(P<0.01),试验C组平均日增重极显著高于试验A组、试验B组和对照组(P<0.01),对照组和试验B组腹泻率极显著高于试验A组和试验C组(P<0.01);在免疫器官指数上,试验B组、试验C组和对照组腹股沟淋巴结指数显著高于试验A组(P<0.05),试验A组、试验B组脾脏指数显著高于试验C组(P<0.05),试验各组肾脏指数均显著高于对照组(P<0.05),试验A组胸腺指数显著高于试验B组和试验C组(P<0.05);在生理水平上,试验组仔猪血液中,中间粒细胞比率、粒细胞比率、中间细胞数量、粒细胞数量、红细胞数量、血红蛋白、红细胞平均体积以及血小板数量低于对照组,且大部分指标表现为差异显著(P<0.05),淋巴细胞比率高于对照组,但差异不显著(P>0.05);在生化水平上,试验B组和试验C组谷草转氨酶含量显著高于对照组和试验A组(P<0.05)。试验结果表明,枯草芽胞杆菌、酵母菌、乳酸菌三者组合的复合益生菌与基础饲粮混合可提高早期断奶仔猪生长性能和体液免疫功能。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

Marc145细胞源EDC3基因的克隆及其生物信息学分析

为获得Marc145细胞源EDC3基因序列,分析其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本试验采用RT-PCR方法从Marc145细胞中扩增EDC3基因,并进行克隆和序列测定;应用DNAStar软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,与参考序列经BLAST比对后分析同源性,并构建系统进化树;利用生物信息学方法对其编码区蛋白进行二级结构、三级结构、B细胞表位、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示,Marc145细胞源EDC3基因长度为1 527 bp,共编码507个氨基酸;EDC3基因编码区核苷酸序列与绿猴、猕猴、狒狒、人、倭黑猩猩、马、野猪、虎鲸、绵羊、非洲象和大熊猫的同源性在91.5%~99.2%之间,与非哺乳动物原鸡同源性最低,仅为81.2%;EDC3氨基酸序列与上述物种的同源性在95.3%~99.6%之间,与原鸡的同源性仅为88.8%。系统进化树结果显示,Marc145细胞源EDC3基因与绿猴的亲缘关系最近,其次是灵长类。蛋白结构预测结果表明,EDC3蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,分别为23.38%和47.35%,二级结构与三级结构预测结果相符。该蛋白存在多个B细胞优势抗原表位,无跨膜结构域及信号肽区域。本试验结果可为Marc145细胞源EDC3基因功能的进一步研究提供参考。     

德菲尔法构建重大动物疫病预警指标体系

[目的 ]构建重大动物疫病暴发流行预警指标体系。[方法 ]以禽流感和口蹄疫为例,采用文献调研法和德菲尔专家咨询法中的专家会议法初拟重大动物疫病预警体系的框架和指标;应用德菲尔专家咨询法评价预警指标的重要性、可操作性;应用组合权重法比较各指标综合影响的大小,并将指标分类。[结果 ]筛选出禽流感和口蹄疫预警预报一级指标6项(易感动物、饲养管理和免疫情况等)以及二级指标14项(免疫效果、环境消毒、温度等),并将指标分为三类(关键指标、重要指标和一般指标)。[结论 ]初步构建了重大动物疫病暴发流行预警指标体系。     

靶向cofilin2基因RNAi对鸭病毒性肠炎病毒增殖的影响

旨在探讨cofilin2基因的表达在鸭病毒性肠炎病毒(DEV)增殖过程中的影响.本研究通过已获得的鸭源cofilin2全基因序列(GenBank登录号:MF434775),设计出4对shRNA序列,插入载体中,并转染到鸭胚成纤维细胞中,经FQ-PCR方法和荧光显微镜观察筛选出具有较高干扰效率的shRNA序列,用干扰效率...     

牛支原体贵州株黏附相关蛋白的初步鉴定

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是引起牛乳腺炎和小牛肺炎等多种牛病的重要病原体。黏附蛋白通常被认为在该生物体的致病机制中起着核心作用。因此,本研究旨在以牛支原体株贵州株(GZ-2)的4个假定蛋白为研究对象,分别命名为M27、M32、M498、M663;分别在大肠杆菌感受态细胞DE3(BL21)中进行原核表达及纯化、亚细胞定位及黏附性研究。结果显示：成功表达和纯化重组M27、M32、M498和M663蛋白;M27、M32和M498蛋白均在牛支原体总蛋白、胞膜蛋白与胞质蛋白中均出现特异印迹条带,而M663未被检测到;共聚焦激光扫描显微镜下的免疫染色结果显示,M27、M32、M498和M663蛋白和牛支原体都能黏附在胚胎牛肺细胞(EBL)上,兔抗M27、M32、M498和M663血清抗体能够抑制蛋白M27、M32、M498和M663对EBL细胞的黏附,也能抑制牛支原体对EBL细胞的黏附。流式细胞术分析结果与其一致,得到了进一步证实。综上所述,M27、M32和M498蛋白是牛支原体的黏附相关蛋白,而M663在Western blot中未被检测到,但它仍能黏附在EBL...     

奶牛乳房炎发生的原因及诊断防治综述

乳房炎是奶牛最常见的疾病之一,它不仅严重影响患病牛的产乳量、乳的品质,延长产后发情时间和妊娠时问,而且危及人的健康。据国际奶牛联合会统计,20世纪70年代,奶牛临床型乳房炎患病率约20%,隐性乳房炎则高达50％;在美国饲养的1100万头奶牛中,半数患有各种类型乳房炎,日本全国平均乳房炎患病率为45．1％,法国奶牛整个第一泌乳期临床型乳房炎发生率为26．3％,在芬兰、挪威、瑞典,乳房健康问题分别造成35％、19%和22%的奶牛淘汰。     

仔猪PRRS母源抗体消长规律的测定

猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称"蓝耳病",是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起的以妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎和幼龄仔猪呼吸道症状为特征的急性接触性传染病.