基于山羊痘病毒P32蛋白间接ELISA方法的建立

通过Ni柱亲和层析和G-100层析技术对真核表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析GPVP32蛋白纯化效果;应用琼脂扩散试验检测纯化蛋白的抗原反应性,并以纯化蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。结果显示,从真核表达产物中获得了纯化的GPVP32蛋白,琼脂扩散试验显示纯化的GPVP32蛋白具有良好的抗原反应性;基于纯化蛋白建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。结果表明,本试验建立的间接ELISA方法可用于山羊痘流行病学的调查和血清抗体水平的监测,为山羊痘的防控提供了有效技术。     

PEDV、TGEV和PoRV三重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、敏感的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)三重PCR检测方法,根据GenBank登录的PEDV S基因、TGEV M基因和PoRV VP7基因参考序列,设计3对特异性引物,以克隆的质粒为模板,进行反应条件的优化以及特异性、敏感性试验。结果采用所建立的方法能够扩增出PEDV、TGEV和PoRV特异性片段,且不能检出PCV2、CSFV、PRRSV;对PEDV、TGEV和PoRV质粒模板的最低检测量分别为1×10~2拷贝/μL、1×100拷贝μL、1×10~3拷贝/μL;对10~2份临床病料进行检测,结果 PEDV、TGEV和PoRV的检出率分别为37.25%、1.96%和6.86%,与单项PCR检测结果进行比较,符合率均为100%。结果表明,所建立的三重PCR检测方法可为猪病毒性腹泻病的快速诊断及流行病学调查提供技术支持。     

贵州省种猪场5种传染病的血清学调查分析

近年来,贵州省一些种猪场出现了一种以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状及生长发育不良为主要临床表现的疫病,严重影响了养猪业的健康发展.研究资料表明,引起上述症状的病毒性传染病主要有猪瘟(hog cholera,HC)、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)、猪伪狂犬病(pseudorabies, PR)、猪细小病毒病(porcine parvovirus infection,PP)和猪圆环病毒病(porcine circovirus infection,PC)等.     

一例禽白血病的病理学分析及qRT-PCR诊断

为查明贵州省惠水县某养殖场鸡发病死亡的原因,对送检鸡进行剖检和病理学观察,并应用qRT-PCR方法对病原核酸进行检测。结果：病(死)鸡肝脏肿大,有明显粟粒状细胞瘤增生,均匀分布于肝实质中,呈灰白色;组织病理切片观察发现大量圆形嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞和广泛的肝细胞空泡变性;病原核酸检测显示禽白血病病毒阳性,确诊为禽白血病病毒感染。     

安卡拉病毒贵州分离株Fiber2基因的克隆及序列分析

Fiber2蛋白是禽腺病毒血清4型(FAdV-4,又称安卡拉病毒)重要的免疫原蛋白,为深入了解FAdV-4贵州株Fiber2基因的遗传变异情况,本研究利用PCR技术扩增FAdV-4贵州晴隆株(GZ-QL)Fiber2基因,胶回收后将其连接至pMD19-T载体,转化入DH5α筛选阳性克隆质粒,经质粒PCR及双酶切鉴定后进行DNA测序,然后对测序结果进行生物信息学分析。结果显示,GZ-QL株Fiber2基因全长为1 440 bp,与四川分离的SCnj1601强毒株、北京分离的NIVD2强毒株Fiber2基因核苷酸同源性均为100.0%,与FAdV-4经典ON1株Fiber2基因核苷酸同源性为95.9%,两者位于相同进化分支。GZ-QL Fiber2蛋白共有33个氨基酸突变位点,其中,在第11～15位之间有5个氨基酸插入;蛋白质亲水性平均值为-0.031,其二级结构以无规则卷曲为主(占51.8%),无跨膜结构域或信号肽,抗原表位分布均匀,预测有8个优势抗原表位区域,且集中于N端。以上结果表明,FAdV-4贵州株GZ-QL Fiber2蛋白在禽腺病毒血清4型内相对保守且抗原性良好,具备成为优势...     

贵州省开阳县某猪场主要猪病的血清学抗体检测分析

为了解贵州省开阳县某猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪O型口蹄疫病毒、猪伪狂犬病病毒的免疫及感染情况,通过采用ELISA检测方法对猪场30份血清进行相关抗体检测.结果:(1)猪O型口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒gB、猪瘟病毒免疫抗体合格率均>70％,免疫效果较好.(2)猪口蹄疫3-ABC抗体阳性率为0,表明猪群无口蹄疫...     

羊口疮病毒ORFV114蛋白生物信息学分析、真核表达及亚细胞定位

【目的】对羊口疮病毒(Orf virus, ORFV)ORFV114蛋白进行生物信息学分析、转录动力学、真核表达及亚细胞定位研究。【方法】使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV114基因进行序列比对分析;分别使用在线网站ExPASy、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA、SWISS-MODEL对ORFV114蛋白进行理化性质分析,以及跨膜区、信号肽、结构预测;在阿糖胞苷(cytarabine, Arac)存在或不存在的情况下,于ORFV感染HeLa细胞后多个时间点收获细胞,RT-PCR扩增ORFV114基因,确定ORFV114蛋白的动态转录水平;PCR扩增ORFV114基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV114重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,经脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染HEK293细胞,通过Western blotting鉴定ORFV114-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV114重组质粒瞬时转染HeLa细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色...     

山羊痘病毒P32基因的PCR-RFLP分析

根据羊痘病毒基因组设计引物,建立了检测羊痘病毒P32基因的PCR方法,并扩增了疫苗毒株、标准毒株、贵州分离株的P32基因;应用生物学软件对山羊痘和绵羊痘病毒P32基因的酶切位点进行分析,选择合适的限制性内切酶对P32基因进行酶切.结果表明,以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量和纯度上均高于Trizol法,更有利于PCR扩增;所建立的PCR方法对细胞感染物及山羊痘疹样本均能扩增出特异性的目的DNA条带;软件分析选择限制性内切酶Hinf I对羊痘病毒P32基因的PCR产物进行酶切鉴定,可以有效区分山羊痘病毒和绵羊痘病毒.     

猪瘟、猪蓝耳病双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了方便、快速检测猪瘟和猪蓝耳病混合感染病例,试验根据GenBank登录的猪瘟病毒(CSFV)和蓝耳病病毒(PRRSV)基因序列,分别设计合成1对引物,建立检测猪瘟、猪蓝耳病的双重RT-PCR方法,并对引物浓度、退火温度进行优化。对优化后的RT-PCR方法进行特异性和敏感性试验,同时对临床样品进行检测。结果表明:采用建立的RT-CPR方法对CSFV、PRRSV进行扩增,分别扩增出508 bp和320 bp特异性片段,最佳引物浓度为0.4 pmoL/μL,最佳退火温度为55℃。采用该方法对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性乙型脑炎病毒不能扩增出任何片段,特异性良好。对CSFV和PRRSV最低核酸检出含量分别为32.4 ng和2.4 ng,具有较好的敏感性。对贵阳市某规模化猪场采集的临床疑似病料检出率为100%。说明成功建立了一种快速鉴别诊断猪瘟和猪蓝耳病的双重RT-PCR方法,该方法具有较好的特异性、灵敏性和临床应用性,为猪瘟和猪蓝耳病的快速、准确鉴别诊断和防控提供了有效手段。     

一例猪附红细胞体病的实验室诊断

为确定贵州省长顺县某养殖场猪群突然发病死亡的原因,无菌采集5头发病猪的血液作为检测病料,采用细菌分离培养、病毒核酸检测和血涂片检查3种方法进行实验室诊断。结果:细菌分离培养和病毒核酸检测均为阴性;血涂片姬姆萨染色镜检显示大部分红细胞边缘不整齐,呈星芒状、锯齿状、刺球状等不规则形状,符合附红细胞体感染特征。结论:猪群发病原因为附红细胞体感染。