间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清2型鸭疫里默氏杆菌抗体的研究

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)感染是危害养鸭业的最重要传染病之一，该病主要呈急性败血症或慢性过程，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和干酪性输卵管炎为特征。RA的血清型很多，其中血清2型在我国的发生频率很高，危害非常严重。目前已建立的用于检测RA抗体的方法有琼脂扩散试验、凝集试验、ELISA等，这些检测方法或是灵敏度不高，或是由于使用抗原成分的不同而存在一些不足，在我国仅仅建立了用于血清1型RA抗体的检测。为能有效对血清2型RA抗体进行血清流行病学调查以及其疫苗的免疫效果进行监测和评价，开展本项研究。     

雏鸭病毒性肝炎的研究进展

雏鸭病毒性肝炎（DuckViralHepatitis，DVH）是由鸭肝炎病毒（DuckHepatitisVirus，DHV）引起雏鸭的一种高度致死性、传播迅速的病毒性疾病，以肝炎为其主要特征。鸭肝炎病毒有三个血清型，可分别引起Ⅰ型、II型和III型雏鸭病毒性肝炎，如果防制不当，死亡率很高，对养鸭场会造成很大的经济损失。１．１Ⅰ型DVHⅠ型DVH最早由Levine和Hofstad于１９４５年在美国发现。Levine和Fabricant（１９５０年）用鸡胚分离到了Ⅰ型DHV。１９５３年后，加拿大、英国、德国、意大利、匈牙利、前苏联、印度、日本等国相继报道了该病。我国黄均…     

分子伴侣在病毒感染中的作用

随着蛋白质研究技术的不断发展，数以百种的蛋白质三维结构已研究得较为清楚，但对于这些蛋白质折叠成天然构象的途径和机制所知甚少。通常认为蛋白质的一级结构决定了蛋白质的三级和四级结构，但近年来研究表明，在很多蛋白质的折叠与装配过程中，有其他蛋白质或酶的参与，其中分子伴侣就是目前研究得最多、最热的一种。病毒是细胞内寄生物，分子伴侣与病毒的增殖过程密切相关，从病毒基因组复制的起始、转录的进行、翻译的完成到病毒粒子的装配成熟．甚至病毒成分在宿主体内的转运都有分子伴侣的参与。随着病毒与分子伴侣相互关系研究的深入，产生了抗病毒的又一个可能的途径。     

伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析

根据已发表的伪狂犬病病毒（PRV）的基因序列,设计合成一对引物PCL1和PCL2,以PRV Fa株的DNA为模板成功地扩增得到预期的长约1.7kb的特异片段,经本科切鉴定,初步确定为gE基因。将扩增产物经Kpn Ⅰ、EcoRⅠ消化形成粘末端克隆到pUC18质粒,得到了明显大于载体的重组质粒PpgE。重组质粒PpgE经本科切鉴定为含有PRV的gE基因,测序PpgE得到完整的gE基因片段,并与4株不同来源的毒株进行了比较分析。5毒株的gE同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达97%,这体现了gE基因的保守性。分析还表明Fa与TNL同源。同时99%的高同源性也显示Fa、Ea、SH可能是同一毒株。gE序列在1040-1410碱基的高同源性区域作为PRV的PCR检测或作为PRV的PCR检测或作为核酸探针是非常重要的。     

鸭病毒性肿头出血症病毒培养特性与形态观察

试验对鸭病毒性肿头出血症病毒在鸭胚上的培养特性、毒力、病毒的纯化及其形态进行了研究。结果表明:该病毒不能感染鸡胚,能在鸭胚上繁殖并传代,在鸭胚上的半数致死量为1×10~(-7.24)/0.2mL;氯化铯超速离心纯化的病毒效果优于蔗糖离心法,电镜观察病毒粒子呈球形或椭圆形,大小为60～80nm,无囊膜。     

鸭瘟病毒CHv株UL34基因的克隆及分子特性分析

通过生物信息学分析、斑点杂交实验、克隆和测序证实了本实验室构建鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)CHv株基因文库时新分离的基因(GenBank登录号EF643562)为DPV UL34基因,进一步运用有关分子生物学软件对该基因进行了分子特性分析。结果表明,该基因大小为831bp,编码276个氨基酸的多肽,含有疱疹病毒UL34类似蛋白家族保守区。系统进化树分析显示,其与α疱疹病毒亚科中马立克病毒属的GaHV-2,GaHV-3,MeHV-1,EHV-1和水痘病毒属的CeHV-9,HHV-3的亲缘关系最近,揭示DPV-CHv株应该被划为α疱疹病毒亚科中的单独一类。该编码蛋白在252～274位氨基酸有一个明显的跨膜区,C末端有一微体靶向序列(ARL),但无信号肽;含有4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个蛋白激酶C磷酸化位点,5个N-豆蔻酰化位点和1个N-糖基化位点;亚细胞定位主要位于细胞核;密码子偏爱性分析显示其偏爱的密码子第3位碱基多以A和T结尾,属于低表达基因;不同密码子使用频率与酵母、大肠杆菌和人的密码子使用频率比较表明,其与大肠杆菌和酵母较接近,与人差异较大。该分析结果揭示DPV UL34基因为一C端锚定的Ⅱ型膜蛋白基因,体外表达选择大肠杆菌和酵母表达系统较为合适,同时该结果也为进一步开展DPV UL34基因的生物学功能研究具有一定的参考作用。     

鸭肠炎病毒UL53截段基因的序列特性、原核表达与其抗原性检测

【目的】通过选取DEV-UL53基因主要抗原域与进行DEV-UL53截段基因B细胞表位多参数预测相结合的策略,高效表达DEV-UL53截段基因,并通过Westernblot分析重组蛋白的免疫原性。【方法】通过生物信息学软件DNAStarProtean模块对UL53基因编码的gK蛋白进行主要抗原域预测,选取主要抗原域对应的UL53截段基因进行二级结构、蛋白质骨架柔性区域、表面可及性区域预测和在线预测该蛋白的亲水性及跨膜区,并对UL53截段基因进行克隆、亚克隆、原核表达与抗原性分析。【结果】UL53截段基因编码蛋白gK的B细胞表位最可能分布于Ala20—Leu25、Ser40—Met47、Leu68—Ile78、Val124—Phe128、Ile129—Tyr134、Asp176—Ile178,构建的阳性表达质粒转入BL21表达宿主菌经IPTG诱导外源基因获得了良好表达,经Westernblot分析表明该重组蛋白具有良好的抗原性。【结论】实现了UL53截段基因的高效表达,经Westernblot分析表明该重组蛋白具备良好的免疫原性,这为DEV-UL53基因及其编码的蛋白gK功能的深入研究、新型疫苗和诊断试剂的研制及开发等提供可用的试验材料。     

鸭病毒性肝炎的研究——弱毒在雏鸭和成年鸭体内分布和排泄

本文首次报道了将鸭肝炎病毒（ＤＨＶ）弱毒株接种鸭（成年鸭和雏鸭）后，用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测不同时间病毒在鸭体各组织器官的分布和由粪便排出的情况，以及同群饲养但不接种ＤＨＶ的雏鸭和成年鸭感染ＤＨＶ弱毒后在体内分布及排泄情况。结果表明，ＤＨＶ弱毒接种１日龄雏鸭后２０小时、接种成年鸭后４８小时即可在直肠中检出ＤＨＶ；雏鸭接种弱毒后用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检出ＤＨＶ的时间顺序是：心、肝、肾、脾、肺、肾和粪便，胸肌和脑未检出ＤＨＶ，同居感染雏鸭检出ＤＨＶ的时间顺序是：肺、肾、心、肝、脾和粪便，同样在胸肌和脑中未检出ＤＨＶ；成年鸭接种弱毒后检出ＤＨＶ的时间顺序为：心、肝、脾、肺和粪便，胸肌和脑未检出ＤＨＶ，同居感染成年鸭检出ＤＨＶ的时间顺序是：肺、肾、心、肝、脾和粪便，胸肌和脑未检出ＤＨＶ。本试验为临床上更好地应用ＤＶＨ弱毒疫苗预防ＤＶＨ提供了理论依据     

免疫组化检测鸭疫里默氏杆菌(RA)方法的建立

本文建立了间接免疫组化法(HRP-间接法)检测组织中的鸭疫里默氏杆菌,并从固定液、抗原修饰方法、洗涤液和洗涤方法、复染液、粘片剂几个方面进行了优化,其结果为以PLP为固定液,以APES为粘片剂,以0.3%的甲醇-H2O2在湿盒中室温下孵育20min消除组织中的过氧化物酶及假过氧化物酶活性,兔抗RAIgG与羊抗兔-HRP的稀释比例均为1∶25,以4℃过夜作兔抗RAIgG的孵育条件,以10%白蛋白0.05%Tween-20pH7.4的PBS湿盒内室温孵育60min处理组织中非特异性染色因素;以TBST为洗涤液,空气振荡器70转/min摇洗2次,每次10min洗涤切片;以0.5%甲苯胺蓝作为复染液。此方法具有特异性强,无假阳性,经济,无需特殊仪器,简单易行的优点。