2016－2019年广西部分猪场仔猪病毒性腹泻的流行病学调查

本研究旨在了解引起仔猪腹泻的主要病毒性病原感染情况及流行特点,为有效防控广西仔猪腹泻提供科学依据。试验采用RT-PCR/PCR检测方法对2016年3月至2019年2月广西14个地级市366个规模猪场送检的914份仔猪腹泻病料样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪Delta冠状病毒（PDCoV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪伪狂犬病病毒（PRV）检测,并分析其阳性率在不同年份、季节、地区之间的差异及病原混合感染情况。调查结果显示,PEDV、PDCoV、PRRSV、PoRV、PCV2、CSFV、PRV均存在不同程度的感染,其样品平均阳性率分别为59.74%、8.32%、7.77%、4.92%、3.72%、3.28%和2.08%,未检测出TGEV;PEDV已无明显季节性,一年四季均高发,即使在炎热的夏季,在感染猪群中也持续存在,PDCoV有明显的季节性,多发生在冬春寒冷季节;广西仔猪腹泻PEDV阳性率高,单一感染高达50.55%,仔猪腹泻混合感染情况也较多,其中以二重感染情况较为常见,同时也存在四重感染现象。结果表明,广西腹泻仔猪存在7种病毒性病原不同程度感染情况,其中以PEDV导致的仔猪病毒性腹泻尤为严重,新发PDCoV阳性率仅次于PEDV,需重视并加强对新发PDCoV的防控。     

隆林黑猪氨肽酶N基因的生物信息学分析和原核表达

本研究旨在进行猪氨肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将pAPN克隆到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒pET-32a-pAPN,使其在大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中表达。经IPTG诱导表达、纯化,产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果显示,隆林黑猪和三元杂商品猪的pAPN基因长2 949 bp,开放性阅读框为2 892 bp,编码963个氨基酸,同源性为100%,与GenBank数据库中公布的标准序列（登录号：NM_214277）相比,隆林黑猪共有5处氨基酸突变,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108Ile和Ser330Pro 4处突变位于pAPN酶催化活性区域,Val621Ile突变位于APN病毒结合区域。pAPN为不稳定的亲水性蛋白,跨膜区位于第17~33位氨基酸,有12个N-糖基化位点,33个B细胞抗原表位预测位点,三级结构为同源二聚体。Val621Ile突变可能影响APN结合病毒的能力。试验成功构建重组质粒pET-32a-pAPN,SDS-PAGE鉴定以包涵体形式表达,纯化后的蛋白在123 ku处有明显条带,且具有良好的抗原性,为进一步获得多克隆抗体、研究该基因和TGEV、PEDV、PDCoV的关系奠定基础。     

应用实时荧光定量RT-PCR检测猪HEV ORF2基因3个连续片段的真核表达水平

将构建的猪戊型肝炎病毒广西株3个连续ORF2基因片段重组真核表达质粒pEASY-LB1、pEASY-LB2、pEASY-LB3转染人肾上皮细胞系293T,应用实时荧光定量RT-PCR检测目的基因LB1、LB2、LB3。经ABI7500系统建立的标准曲线相关系数（R2）范围为0.994 209-0.999 130,斜率范围-3.469 403-3.579 107,扩增效率范围为90.28%94.19%。经对转染细胞、空白对照细胞的目的基因、内参基因的扩增曲线和融解曲线分析,表明该实时荧光定量PCR扩增体系的特异性良好,通过2-ΔΔCt相对定量法计算,可得出转染细胞293T-a、293T-b、293Tc目的基因LB1、LB2、LB3的基因表达量分别为6 226 830.88±826 430.14、9 449 238.68±926 057.13、35 177 915.63±3 949 173.42。本实验室建立的3个重组真核表达质粒在293T细胞中的转染成功为深入研究猪戊型肝炎基因工程疫苗奠定了基础。     

2017—2020年广西部分猪场送检血清猪伪狂犬病抗体检测

为了解广西猪场伪狂犬病毒（PRV）感染和免疫状况,2017年1月—2020年12月,对部分猪场随机采样送检的血清样品,应用ELISA方法开展PRV血清抗体检测,并对检测结果进行不同年份、不同季节、不同地区、不同生长阶段猪群的统计分析。结果显示：从时间分布上看,2018年PRV gE抗体场阳性率（57.71%）和个体阳性率（24.75%）均最高,此后呈逐年下降趋势,其中个体阳性率下降明显（P＜0.05）,2020年下降至6.14%;各年间的PRV gB抗体场合格率差异不显著（P＞0.05）,均在90%以上,而2019年的个体阳性率（88.71%）最低,与其他年份差异显著（P＜0.05）。冬季PRV gE和gB抗体个体阳性率最低,分别为14.96%和89.35%,与其他季节差异明显（P＜0.05）;冬季gE抗体场阳性率（42.97%）最低,与春季、秋季差异不显著（P＞0.05）,但显著低于夏季（P＜0.05）,而gB抗体场合格率一年四季差异不显著（P＞0.05）,均在95%以上。从空间分布上看,广西14个地市猪场均存在不同程度的PRV野毒感染,其中玉林市最严重,场阳性率和个体阳性率分别为69.51%和35.86%,而钦州市最轻,分别为16.67%和4.07%;PRV gB抗体个体合格率普遍较高,均在84%以上。从不同生长阶段猪群上看,后备母猪、育肥猪PRV gE和gB抗体个体阳性率均显著低于其他生长阶段猪群（P＜0.05）,其中gE抗体个体阳性率在13%以下,而gB抗体个体阳性率不足80%。结果表明,近年广西规模猪场PRV野毒感染率较高,而疫苗免疫并不能完全阻止野毒株感染。建议通过PRV净化和提高规模猪场生物安全水平等措施来控制其流行。本研究为制定合理的猪伪狂犬病防控与净化策略提供了依据。     

胞内劳森菌人工感染猪的病理学观察

将猪源胞内劳森菌GXNN株在兔体传代,用感染兔肠道黏膜及内容物攻毒试验猪,成功复制出猪增生性肠炎,病猪表现为生长缓慢,腹泻,攻毒后12 d~17 d体温升高,肠系膜淋巴结肿大,回肠黏膜皱褶增厚等;病理组织学观察可见回肠有丰富的集合淋巴小结,回肠腺窝杯状细胞消失,部分腺窝上皮细胞增生,淋巴结内的淋巴小结数目增多。     

NS复合乳酸菌制剂对商品猪机体免疫水平的影响

为了研究微生态制剂NS复合乳酸菌对商品猪体液免疫和细胞免疫水平的影响,试验采用杜长二元杂交商品猪81头,按体重和性别分成3组,A组为对照组(饲喂基础日粮),B组添加0.2%NS复合乳酸菌制剂,C组添加0.2%六味酸制剂。测定试验前(0天)及试验第30天各组猪血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM含量和猪瘟、伪狂犬病、蓝耳病病毒抗体水平。结果表明:在商品猪饲料中添加NS复合乳酸菌制剂能够有效增强商品猪的体液免疫功能,提高猪瘟疫苗的抗体水平,还能增加商品猪外周血T细胞CD3+和CD4+T淋巴细胞亚群的比例,调节CD4+/CD8+亚群比值,对商品猪的细胞免疫功能也有较好的增强和调节作用。     

广西猪乙型脑炎血清流行病学调查分析

【目的】了解广西地区猪乙型脑炎（JE）的感染情况及流行态势,为制定广西猪群JE监测和防控体系提供参考依据。【方法】2008～2010年,采集广西边境14市未经JE疫苗免疫的2597份猪血清,采用LAT检测乙型脑炎病毒（JEV）血清抗体,并对不同区域、季节和年龄段等猪群JE流行状况进行分析。【结果】广西受检猪群JEV血清抗体平均阳性率为60.65%;感染率以桂南地区最高（72.15%）,桂北地区最低（35.71%）;夏秋季节（5～11月）是主要流行季节,平均JEV血清抗体阳性率达70.67%,3～4月仅为26.75%;2008～2010年,猪群JEV血清抗体阳性率总体呈上升趋势。【结论】广西受检猪群JE感染较普遍,有一定的地域性及季节性,且感染率呈逐年上升趋势。猪是JEV重要的贮存宿主及传染源,应采取有效的监测与防控措施,杜绝猪JE的流行传播。     

猪丁型冠状病毒CH/GX/1468B/2017的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究于广西某猪场采集疑似感染猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的腹泻仔猪小肠及其内容物进行病毒分离,并通过细胞病变(CPE)、RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和全基因序列测定分析对分离的病毒进行鉴定。结果显示,试验成功分离到1株PDCoV,命名为CH/GX/1468B/2017(简称PDCoV 1468B)。该毒株可稳定有效地在LLC-PK细胞生长增殖,并引起典型CPE;该毒株已在LLC-PK细胞连续传代15代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在10~(8.10)TCID_(50)/mL以上。该毒株全基因组序列长25 399 nt;与23个GenBank中登录的参考毒株的全基因组序列比对显示,核苷酸同源性为97.2%～99.4%,其中PDCoV 1468B分离毒株与Vietnam/Binh21/2015株同源性最高,为99.4%。全基因组系统进化分析显示,PDCoV 1468B分离毒株属于Ⅱ群,与东南亚国家PDCoV毒株亲缘关系密切,处于同一进化分支。综上所述,本研究成功分离出PDCoV 1468B株并进行了全基因序列分析,为进一步开展PDCoV致病性等生物学特性研究及疫苗研制奠定了基础,同时可为PDCoV的遗传进化提供数据支持。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对细胞培养物进行鉴定,应用下一代测序技术对分离毒株全基因组序列进行测定。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为CH/GX/2015/750A。该毒株可稳定有效地在Vero细胞生长增殖,并引起典型的细胞病变;已在Vero细胞连续传代25代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在107.50TCID50/mL。该毒株全基因组序列长28 038bp;与22个参考毒株的全基因序列比对显示,核苷酸同源性为96.8%~99.8%,其中与YC2014株同源性最高,为99.8%。全基因组和S基因系统进化分析显示,PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株属于Ⅱa亚群,与YC2014、PEDV-WS等变异毒株亲缘关系密切。结果表明,本研究分离获得的CH/GX/2015/750A毒株是PEDV地方流行变异毒株。