胸膜肺炎放线杆菌4型菌毛亚单位基因apfA特异性片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板，PCR扩增其apfA特异性基因片段，PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切及序列分析鉴定后，亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，构建重组表达质粒pGEX-apfA，转化到感受态大肠杆菌DE3中，以IPTG进行诱导，进行SDS-PAGE电泳。结果表明，25-4株apfA基因与基因库中标准7型apfA基因的同源性达到98％，所表达的融合蛋白相对分子质量约为42000，与预测值相符。apfA特异性基因片段的成功克隆和表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病致病机理的研究及新型疫苗的研制打下了基础。     

胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD600nm值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长...     

猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗在小鼠体内的免疫机制及其保护效力

 【目的】欲构建具有较好交叉免疫保护效果的多组分重组亚单位疫苗，从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。【方法】 利用分子克隆和重组表达技术获得了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要毒力因子rApxI、rApxII、rApxIII、rApxIV、rApfa和rOMP。并设立以灭活苗（5×108cfu）为试验I组，以重组蛋白rApxI、rApxII、rApxIII和rOMP为试验II组，以rApxI、rApxII、rApxIII、rApxIV、rApfa和rOMP为试验III组，以PBS为空白对照组。分3次免疫BALB/c小鼠，每次间隔2周，第3次免疫后的第7天以APP1型（5×109cfu）和APP2型（5×1010cfu）进行攻毒保护试验。【结果】试验II组的4种抗体水平（ApxI、ApxII、ApxIII和OMP）和脾淋巴细胞诱生IL-2水平显著高于其它3组(P<0.05)，脾淋巴细胞增殖水平也一直高于其它3组(P>0.05)。且试验II组对APP1型保护作用（9/10）明显高于试验I组（6/10）、试验III组(5/10)和对照组（0/10），而对APP2型保护作用（无肺脏损伤）也明显优于其它3组（典型肺部损伤），显示出细胞免疫和体液免疫水平与免疫攻毒保护之间存在着正相关性。【结论】试验II组通过激活体液免疫和细胞免疫，对不同血清型APP的攻击提供了很好的交叉保护作用。     

猪附红细胞体PCR检测方法的建立

 根据已发表的部分猪附红细胞体序列设计了一对特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增出了一条约936 bp的基因片段，并成功地将该基因克隆于克隆载体PMD18-T，经酶切分析和PCR进一步鉴定后进行序列测定，结果表明，所克隆的目的基因与GenBank中发表的序列一致。并利用特异性引物初步建立了猪附红细胞体病PCR检测技术。     

沙地樟子松天然纯林的结构特征

[目的]为了解红花尔基地区沙地樟子松天然纯林的结构特征,指导沙地樟子松的保护与经营。[方法]在红花尔基地区设置2块100 m×100 m的樟子松天然纯林固定样地,利用样地内每木定位调查数据和分析统计软件进行一元分布及二元分布特征分析。[结果](1)樟子松天然林纯林直径分布为单峰或多峰山状分布,垂直结构简单,只有乔木层和草本层。(2)樟子松天然纯林的林木分布格局为均匀分布,接近随机分布,林木分布格局类型与林分密度无关;林分中樟子松个体竞争激烈,多数单元中林木呈较密集状态。(3)2块样地中随机分布状态下的林木多数为中等密集或比较密集,不同分布状态下的林木优劣性差异较小;低密度樟子松天然纯林中多数密集状态的林木为绝对优势木或优势木,而高密度林分中林木密集度分布与林木大小无关。[结论]红花尔基沙地樟子松天然林结构不合理,应选择病腐木及聚集分布的个体作为潜在调整对象,进行密度调整和结构优化。     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术（SOE）剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a（＋）中,得到重组质粒pET64-85.该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21（DE3）转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2＋螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.     

抗牛γ-干扰素特异性单克隆抗体的制备

为了制备抗牛γ-干扰素(IFN-γ)的单克隆抗体(McAb),并对其部分生物学特性进行初步研究,试验用重组牛IFN-γ蛋白免疫小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术和间接ELISA方法进行试验.结果表明:共获得5株抗IFN-γ的单克隆抗体,Ig亚类鉴定均为IgGI,轻链为k链;经Weatern-blot试验证实5株McAb均能与IFN-γ发生特异性反应,而与其他蛋白不发生反应,特异性好;以5株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水,效价均达到1:50 000以上.     

禽致病性大肠杆菌生物被膜的形成及其影响因素

为确定影响细菌生物被膜(BF)的形成条件,本研究采用BF体外定性观察和定量粘附性检测两种方法对1株野生禽致病性大肠杆菌(E.coli)在不同环境(培养时间、培养基类型、引导载体类型、营养条件)下产生BF的差异进行了研究。结果显示野生禽致病性E.coli其宿主体外BF最适形成条件是培养时间为48h,培养基为5%TSB、引导载体为平底96孔聚苯乙烯微孔板(美国Corning Costar)。其生长周期为8h时开始起始粘附、24h形成若干微菌落、36h微菌落粘连、48h形成完整的BF、72h细菌脱落开始下一轮的BF生长。糖分和适量的无机盐都可以在一定程度上促进BF的形成和被膜内细菌的粘附性提高。该研究表明禽致病性E.coliBF的形成周期,并为抑制其形成提供了实验依据。