牛分枝杆菌二价组合及融合DNA疫苗的免疫效果

利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64基因和ag85b-mpb64融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建二基因融合(pCDNA-MPB64/Ag85B,pCMA)和二价组合(pCDNA-Ag85B+pCDNA-MPB64,pCA+pCM)DNA疫苗.以牛分枝杆菌卡介苗(BCG)为阳性对照,以pCDNA3.1(+)和PBS为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ及IL-2分泌情况.结果显示:融合DNA疫苗组免疫小鼠血清抗体水平、刺激值(SI值)及IFN-γ和IL-2的分泌水平均明显高于其他各组(P<0.05).二价组合DNA疫苗组的体液和细胞免疫指标与BCG组相当(P>0.05),而显著高于两阴性对照组(P<0.05).     

牛分支杆菌热休克蛋白65基因的分子克隆和表达

以牛型分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增热休克蛋白65(Hsp65)基因,PCR产物经纯化与EcoRⅠ/SaⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pGEX-6P-1进行连接,转化感受态细胞BL21中,筛选和构建了原核重组表达质粒pGEX-H65,核苷酸序列测定验证其正确性.以1 Mol/LIPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,Hsp65基因表达的融合蛋白GST-H65裂解为两部分;即64 kD和22 kD,两个蛋白分子量相加与预测的86 kD(HsP60 kD GST26 kD)相符.牛分支杆菌热休克蛋白HSP65的成功表达为其功能的研究打下基础.     

金色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和副溶血弧菌单管多重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据金黄色葡萄球菌（Staphylococcus auretls，SA）耐热核酸酶（nut）基因、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi，ST）鞭毛抗原（H1-d）基因和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）热稳定直接溶血素（tdh）基因，分别设计了三对引物Nuc-F／Nu-R、H1-d—F／H1-d—R和Tdh-F／Tdh-R，预计PCR扩增的DNA片断分别为279bp、202bp和458bp。通过对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、退火温度和dNTP浓度等的优化，建立了快速检测金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和副溶血弧菌的单管多重PCR方法，该方法检测的敏感性分别为：47．8PgST的基因组DNA．22．7PgSA的基因组DNA和0．3745PgVP的基因组DNA。模拟试验显示最低检测限度为分别为：SA150CFU／反应体系，ST98CFU／反应体系，VP53CFU／反应体系。表明该方法具有很好的应用价值和开发前景。     

猪传染性胸膜肺炎的诊断技术

猪传染性胸膜肺炎（PCP）,是一种高度传染性、致死性的呼吸系统传染病。该病的主要特征是急性与亚急性病例呈现纤维素性出血性胸膜肺炎、慢性病例呈现纤维素性坏死性胸膜肺炎。1957年,英国人Pattison等首次发现该病,目前已在世界各国广泛流行,造成巨大的经济损失,严重阻碍了世界养猪业的健康发展,     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因在真核细胞中的表达及检测

利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌1 050 bp的外膜蛋白H基因(omph)片段,克隆到pMD18-T上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pOMPH,将该重组质粒体外转染SP2/0细胞,检测其表达情况。结果表明本试验成功构建了真核表达质粒pOMPH,通过RT-PCR由转染了重组质粒的SP2/0细胞中扩增出了目的条带,Western blotting分析结果显示重组质粒pOMPH转染的SP2/0细胞泳道出现38ku的特异条带,间接免疫荧光分析表明在转染了pOMPH的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明omph基因在SP2/0细胞中成功表达了活性蛋白,从而为进一步研制DNA疫苗奠定了基础。     

猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

应用SMART技术构建猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选与副猪嗜血杆菌(HPS)细胞致死膨胀毒素(CDT)不同亚基蛋白相互作用蛋白奠定基础。提取PK-15的总RNA,经LD-PCR合成双链cDNA,运用SMART技术,再通过同源重组的方法,构建了PK-15细胞的酵母cDNA文库。经检测,文库滴度达到了2.8×108CFU·mL-1,插入的双链cDNA片段范围为300～1 000 bp,片段平均大小为500 bp。此文库可用于筛选与HPS CDT不同亚基蛋白相互作用的蛋白,这将为治疗靶点的选择、基因缺失弱毒活疫苗的设计提供科学依据。     

多杀性巴氏杆菌毒力因子、免疫原及重要基因研究进展

多杀性巴氏杆菌可引起禽霍乱、猪萎缩性鼻炎等多种动物疫病,是重要的动物病原微生物之一。其基因组编码的多种产物在该菌的致病性及诱导免疫应答方面具有重要作用,已成为研究的热点。作者就国内外多杀性巴氏杆菌荚膜、外膜蛋白、脂多糖等毒力因子和免疫原及其相关基因的研究进展进行了简要概述。     

牛结核杆菌MPB64蛋白的真核表达

利用PCR技术扩增出牛结核杆菌mpb64基因片段,克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pCM64,将该重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验和Western blotting检测目的基因的表达情况.结果表明,在转染了重组质粒pCM64的SP2/0细胞中出现绿色荧光,转染的SP2/0细胞泳道23 kDa处出现特异条带,说明mpb64基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达.     

禽多杀性巴氏杆菌ompa DNA疫苗在小鼠体内免疫效果试验

应用PCR技术扩增获得禽多杀性巴氏杆菌的ompa基因片段,克隆到pUCm-T载体,再亚克隆到真核表达质粒载体pCDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcA,体外转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验检测其转录表达情况。动物免疫分为3组:pCDNA3.1(+)组、PBS对照组和pcA组,每组16只BALB/c小鼠,pCDNA3.1(+)组和pcA组以100μg/只的剂量肌注免疫,PBS组每只小鼠肌注100μL 1×PBS,各组均免疫3次,每次间隔2周。间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,三免2周后检测脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况。强毒攻击,计算小鼠存活数目及保护率。结果显示,间接免疫荧光试验和RT-PCR检测结果均表明pcA可在体外培养的Vero细胞中表达目的蛋白。动物免疫后,pcA组免疫小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)组和PBS组相比差异极为显著(P<0.01)。经提取的禽多杀性巴氏杆菌总外膜蛋白(Omps)刺激后,pcA组的刺激值(SI值)与pCDNA3.1(+)组及PBS免疫组相比均差异显著(P<0.05)。脾细胞产生的IFN-...     

重组ApxⅡA对胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗免疫效果的影响

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的结构基因ApxⅡA克隆到原核表达载体pGEX-6P-1，并在大肠埃希氏菌中进行了表达，表达产物rApxⅡA以包涵体形式存在。为了检测rApxⅡA的免疫原性，分别用rApxⅡA、灭活疫苗以及灭活疫苗添加rApxⅡA对比利时白兔进行了免疫。免疫后进行攻毒，所用菌株分别为同型菌株（APP7型L25—4株）和异型菌株（APP1型4074株）。结果，免疫动物对相同血清型菌株的攻击获得完全保护，且对异型菌的攻击也获得一定保护作用。表明，rApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性，作为抗原成分添加到灭活疫苗中后可提高灭活疫苗的免疫效果。