猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因.     

猪圆环病毒Ⅰ型荧光定量PCR检测方法的建立

以定量的10倍系列稀释的质量pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了PCV1检测的荧光定量PCR方法.结果表明该方法检测灵敏度可达1.0×104拷贝/μL,线性范围为1010～101;对起始浓度为1.0X107、1.0×106、1.0×106拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nPCR)具有相近的灵敏度.     

猪繁殖与呼吸综合征河南毒株Henan-1的分离及其NSP2、ORF3、ORF5的序列分析

将2007年1月河南省某猪场送检的疑似高热病病料处理后接种于Marc-145细胞,出现细胞聚集、固缩、脱落等特异性细胞病变.根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的基因序列设计并合成针对NSP2、ORF3和ORF5基因的引物,RT-PCR扩增目的基因并将其克隆入pMD18-T载体进行测序.并与国内外已发表的毒株的序列进行比较.结果表明:分离毒株Henan-1是美洲型PRRSV,而且NSP2基因发生30个AA的不连续缺失;Henan-1的NSP2、ORF3和ORF5基因与JXA1、JX0612、HZ-X、HB-1(sh)、CH-la、HB-2(sh)、SP、ATCC VR-2332、Henan-HN1、Resp PRRS/Repro MLV、PA8、BJ-4等毒株等位基因的核苷酸同源性分别为83.0%～99.0%、88.3%～99.2%、88.6%～99.5%,推导的氨基酸同源性分别为66.7%～97.9%、84.7%～98.8%、87.1%～99.5%;而ORF3和ORF5基因与LV4.2.1等位基因核苷酸同源性分别为64.7%和64.2%,推导的氨基酸同源性分别为56.7%和61.0%.基因系统发育树分析表明:Henan-1与JXA1、JX0612株的亲缘关系很近,与HB-1(sh)亲缘关系较近,与HZ-X、CH-1a、HB-2(sh)、SP、RespPRRS/Repro MLV等毒株处于不同的分支.     

牛源性无乳链球菌血清型分布及抗生素耐药性研究

本研究旨在查明牛源性无乳链球菌血清型分布及对常见抗生素的耐药情况,指导临床合理用药。对从中国部分地区奶牛场采集的临床型乳房炎病牛乳中分离鉴定出78株无乳链球菌地方菌株,制备沉淀反应抗原及6株标准血清型无乳链球菌单因子血清抗体,采用环状沉淀试验,对78株无乳链球菌地方菌株进行了血清学分型鉴定;同时采用K-B纸片法测定了这些菌株对抗生素的耐药情况。结果表明,引起奶牛乳房炎的无乳链球菌血清型主要为X型(60.26%),其次为Ⅲ型(10.26%)、R型(7.69%)、Ⅱ型(7.69%)和Ⅰb型(5.13%),Ⅰa型尚未发现。无乳链球菌对目前临床上使用的大部分抗生素,如头孢唑啉、头孢噻肟、丁胺卡那霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、强力霉素、氟苯尼考、多黏菌素B、环丙沙星、氟哌酸和头孢他啶/棒酸均较敏感;但对氨苄青霉素、链霉素、恩诺沙星、阿莫西林/棒酸和复方新诺明,有一定的耐药性,其耐药率达50%~100%。本研究对进一步研制有效的药物及疫苗,指导临床合理用药具有重要的意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达

根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV GD)的序列,设计一对引物。用保存的PRRSV GD 的ORF5 的克隆产物pMD ORF5 质粒作为模板,扩增ORF5基因。将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达。用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达。     

中国猪业面临的难点及发展前景（三）—关于猪的健康管理

金猪拱门，万物更新！在过去的2006年， 中国的养猪产业历经了市场从极度低迷到大幅回升的起落，更承受了从猪链球菌病到所谓的猪“高热病”的困扰。面对如此现状，猪产业的从业者们从各个角度进行了对策思考、实践总结、专家、学者等则对此进行了调研、分析研究与反思，获得了许多宝贵的经验及对未来猪产业发展的指导意见。本刊编辑部通过专访的形式将这些文稿汇集起来，归纳成若干主题陆续发表，以飨读者！本期刊发的为农业部种猪质量监督检验测试中心（广州）樊福好博士、中国畜牧业协会养猪分会荆继忠副秘书长、广东省农业科学院兽医研究所宋长绪博士及美国谷物协会闫之春博士的关于中国猪业生产中健康管理方面的热点问题的专访稿。[编者按]     

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建…

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩＸ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ酶切法，ＰＣＲ和核酸探针法进行     

猪渗出性皮炎病原的分离鉴定

从疑似渗出性皮炎的哺乳仔猪体内分离到一株细菌,经革兰染色镜检以及TH-16S细菌生化鉴定系统和葡萄球菌16S rRNA、gap基因通用引物鉴定.结果表明,该菌株为葡萄球菌,gap基因的核苷酸同源性为99%.动物试验发现,试验小鼠出现躁动、被毛竖立、精神沉郁,18 h死亡,说明该菌株对小鼠具有致病力.     

荷斯坦奶牛子宫内膜上皮细胞的体外培养

为建立和完善奶牛子宫内膜上皮细胞的体外培养技术,采用组织培养和胶原酶消化相结合的方法,对中国荷斯坦奶牛的子宫内膜上皮细胞进行了原代分离培养,经胰酶差时消化进行纯化,并以免疫组化法检测角蛋白表达。结果显示,所采用的方法可高效获得呈铺路石样的上皮细胞,角蛋白表达呈阳性,第2~8代的传代细胞在形态特征和增殖状态上保持着与原代细胞相近的生物学特征。