猪源口蹄疫病毒China99/S株基因组全长cDNA的构建及其感染性鉴定

提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmB Ⅰ/Xma Ⅰ、Xma Ⅰ/BamH Ⅰ、BamH Ⅰ/Not Ⅰ、Hpa Ⅰ/Kpn Ⅰ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠ cDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pP1-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定.结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾.其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段.将pPⅠ FMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应.利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒.     

猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析(英文)

[目的]鉴定由猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭(编号为HN/XT)发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。CSFV和PCV2的鉴定:间接免疫荧光法操作。PRRSV的鉴定:由于PRRSV可致Marc-145细胞发生病变,故可由细胞病变与否作出初步鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。     

家畜布鲁氏菌BP26基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

利用原核表达的布鲁氏菌BP26蛋白作为标准抗原蛋白,建立布鲁氏菌病抗体检测方法。本试验从布鲁氏菌S2疫苗株通过PCR扩增获得BP26基因,构建融合表达质粒pET-28a-BP26后并转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达,应用Western blot鉴定表达产物,并以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立布鲁氏菌病抗体ELISA检测方法。结果表明,通过反应条件优化确定抗原的适宜包被浓度为5μg/mL,血清适宜稀释度为1∶20,二抗的适宜工作浓度为1∶20 000;通过敏感性试验结果表明,当血清稀释至1∶1 280时,仍检测为阳性;通过批间、批内重复性试验,变异系数均小于10%,表明本检测方法具有较高的重复性。用该方法对100份临床样本进行检测,并与试管凝集试验(SAT)进行相符性验证,符合率为94%,为布鲁氏菌病临床血清抗体检测及流行病学调查提供了技术手段。     

口蹄疫病毒OT株的全基因组序列测定及比较分析

参考GenBank上已发表的口蹄疫病毒(FMDV)全长基因组序列,设计了覆盖基因组全长的数对引物,通过RT-PCR方法对口蹄疫病毒OT株进行分段克隆及序列测定.结果表明不含poly(C)序列的OT株基因组全序列长8 142 nt,开放读码框(ORF)长6 969 nt、编码2 322 aa,5'UTR长1 004 nt,3'UTR长93 nt,3'UTR之后为23nt的poly(A)尾巴.应用分子生物学软件将OT株与FMDV其它参考毒株进行序列比对,并对其基因特征进行分析.结果显示,OT株的假结节(Pseudoknots)从第415-499位连续缺失85 nt,但是其3A基因却未发生碱基的缺失.其VP1基因的核苷酸同源性与O/Akesu58、OMⅢ两株最高,但OT株在进化时间上要比O/Akesu58、OMIII早很多,其毒株起源和遗传衍化关系还需要进一步的关注.     

湖北省羊口疮病毒的分离鉴定

利用MDBK传代细胞系对湖北通山县某羊场疑似羊口疮(Orf)的黑山羊病料进行分离,通过病毒理化特性试验、动物回归试验和PCR等方法对分离的毒株进行鉴定。结果表明,病料悬液接种MDBK细胞后出现细胞病变,接种病料的羊只出现典型的Orf症状,扩增出羊口疮病毒(Orf virus)B2L基因,该毒株与台湾山羊株(EU935106.1、DQ904351.1)相似性最高(均为99%),亲缘关系最近。本研究成功分离鉴定到一株ORFV,命名为ORFV/HB/09。     

羊口疮病毒ORF129基因的原核表达、纯化及鉴定

试验旨在克隆羊口疮病毒ORF129基因,并对其编码蛋白进行表达及纯化。参照GenBank已发表羊口疮病毒OV-IA82株ORF129基因序列(登录号:AY386263.1),用Primer Premier 5.0软件设计合成1对特异性引物,利用PCR方法扩增ORF129全基因序列,将其与质粒pET-28a(+)经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET-28a(+)-ORF129。重组质粒经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌Rosttta感受态细胞,利用IPTG诱导ORF129基因的表达,经SDS-PAGE分析后,将表达产物超声破碎、洗涤、溶解,然后采用尿素梯度透析方法进行复性,经亲和层析法纯化目的蛋白并通过Western blotting对其进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果表明,本试验成功构建了重组质粒,读码框正确,菌液起始D600nm值为0.4~0.8,37℃、220r/min、1mmol/L IPTG诱导3h时能得到ORF129包涵体蛋白,蛋白大小为58ku,在加入精氨酸、甘油的复性液中,蛋白复性率较高,将复性后蛋白与Ni柱结合,在咪唑浓度为500mmol/L时,能将蛋白洗脱,纯化的蛋白经Western blotting鉴定正确,证明蛋白成功表达。本研究成功构建了羊口疮病毒ORF129基因原核表达重组质粒,并成功表达和纯化了ORF129蛋白,为后续羊口疮病毒检测方法的建立奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒湖北株的鉴定及分子特征分析

为了确诊疑似羊传染性脓疱病例,分析羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV)的分子特征,作者以湖北某羊场疑似传染性脓疱病料为对象,进行了电镜观察、病理切片染色、特异性目的基因扩增和序列测定及遗传进化关系分析。结果在电镜下观察到ORFV样粒子,切片HE染色可见有炎性细胞浸润,自病料中扩增出特异性目的ORFVB2L基因片段(GenBank序列号GU320351)。结果表明该病例为黑山羊传染性脓疱病毒引起,序列遗传进化分析表明该病毒和2007年分离于中国台湾的毒株(DQ904351)遗传关系最近,和印度2004到2005年分离于绵羊(DQ263306、DQ263305)、山羊(DQ263304、DQ263303)的ORFV同属于一个进化分支。本研究为ORFV分子流行病学研究积累了资料。     

猪圆环病毒2型河北株的全基因组克隆与系统进化分析

应用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的死亡仔猪组织病料中扩增出PCV-2全基因组（1767bp）,将此基因片段克隆入pMD20-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV2并对其进行序列测定,然后对全基因组进行同源性和遗传进化分析。结果表明,PCV-2分离毒株与参考株的全基N组同源性介于94％～98．4％之间,ORF1的同源性介于97．0％～98．8％,ORF2的同源性略低,介于91．9％～98．4％之间。该毒株与荷兰株、广西株和上海株等在一个进化分支上。本研究有助于监测PCV-2的疫源和进化关系,为进一步深入研究病毒基因功能奠定一定基础。     

牛场爆发犊牛球虫病的诊治

正牛球虫病系由艾美耳科(Eimeriidae)的艾美耳属(Eimeria)或等孢属(Isospora)的多种球虫引起的一种寄生虫病,主要病变特征为出血性肠炎。犊牛对球虫的易感性高,且病情严重,成年牛常呈隐性感染,成为带虫者。牛感染球虫后肠道上皮细胞被破坏,正常的营养吸收受阻,致使其生长缓慢或产奶量     

猪膜联蛋白A2多克隆抗体的制备、亲和纯化与鉴定

本研究旨在制备并亲和纯化兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。通过PCR从质粒pA2-EGFP中将编码猪膜联蛋白A2与增强型绿色荧光蛋白融合基因(Annex A2-EGFP)亚克隆到pET-30a(+),构建了原核表达质粒p30a/AE,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导以包涵体形式表达了猪ANNXA2-EGFP融合蛋白,用Ni-Resin HP树脂对表达的目的蛋白进行亲和纯化。用纯化的ANNXA2-EGFP融合蛋白免疫兔,制备兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。将以前纯化的猪可溶性GST-ANNXA2融合蛋白偶联NHS活化琼脂糖凝胶FF,亲和纯化多克隆抗体。用GST-ANNXA2亲和纯化的多抗效价达到1∶12800,Western blot和免疫组化结果证实具有高特异性。制备的高效价和高特异性兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体,为进一步研究膜联蛋白A2在病毒感染中的作用奠定了基础。