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221.
生物素标记寡核苷酸探针原位检测石蜡切片鸭瘟病毒核酸 总被引:1,自引:0,他引:1
据GenBank中有关鸭瘟病毒(DPV)的1个765 bp的EcoRⅠ片段序列,用Oligo软件设计长度为37 bp的寡核苷酸并用生物素标记制备探针,经blast分析和斑点杂交检测探针的特异性后,建立从石蜡切片中检测出DPV核酸的原位杂交方法并对人工感染死亡鸭的各组织器官进行检测,结果显示:(1)寡核苷酸探针能特异性检测到DPV强毒CHv株DNA,对鸭病毒性肝炎病毒QL79株RNA、血清1型鸭疲里默氏杆菌DNA、鸭源多杀性巴氏杆菌DNA、鸭沙门菌DNA和大肠杆菌DNA的检测结果为阴性.(2)以寡核苷酸探针建立的从石蜡切片中检测出DPV核酸的原位杂交方法的最佳反应条件为:组织切片先用0.2 mol/L HCl 37℃处理20 min,然后用100 mg/L的蛋白酶K 37℃消化15 min左右;杂交时探针工作浓度为350 μg/L;Avidin-AP的工作稀释度为1:100.(3)以所建立的原位杂交法检测DPV-CHv强毒人工感染死亡鸭的各组织器官,结果肝脏、肠道、法氏囊、脾脏、食道、肺脏和肾脏呈阳性反应,DPV的DNA分布于特定细胞的细胞浆和细胞核.结果表明,原位杂交检测石蜡切片中DPV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DPV进行检测和病原定位的良好方法,可用于DPV的侵染过程和致病机理研究及回顾性诊断检测. 相似文献
222.
为使鸡IL-18成熟蛋白基因在真核系统中高效表达,对其进行定点突变,将酵母低频密码子突变为偏嗜性密码子,构建了鸡IL-18成熟蛋白变构基因真核重组表达载体pPICZαA-MChIL18*,并将其转化入P.pastoris X-33.重组菌株X-33/pPICZαA-MChIL18*经甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE检测,结果在约23 000处有目的条带,与预期的相对分子质量一致,占总蛋白的45%,对其进行Western-blot检测,结果与兔抗鸡IL-18多克隆抗体发生特异性免疫反应.结果表明,鸡IL-18成熟蛋白变构基因在毕赤酵母中成功的进行了表达. 相似文献
223.
根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)的基因序列,在PRVgE基因阅读框外的上、下分别设计一对引物P1和P2,在引物的 5’端分别加上 KpnI和 EcoRI位点。以 PRV Fa株的 DNA为模板成功地扩增得到一条长的 1.7kb的片段,经酶切鉴定,初步确定为gE基因。将此PCR产物经KpnI、EcoRI消化后与同样酶切的PUC18质粒连接、转化,得到了明显大于载体的重组质粒PPgE。重组质粒PPgE经酶切鉴定确定为含有PRV 的 gE基因,测序PpgE得到完整的gE基因片段,并与4株不同来源的毒株进行了比较分析。在对 PRV Fa(来自福建)、Rice(来自俄国)、TNL(来自台湾)、Ea(来自武汉)、SH(来自上海)的gE同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达97%,这一定程度上也体现gE基因组的保守性。分析还表明Fa与TNL同源。同时99%的高同源性也显示 Fa、Ea、SH可能是同一毒株。本实验认为 gE序列在 1040- 1410碱基的高同源性区域作为PCR检测或核酸探针是非常有用的。 相似文献