猪伪狂犬病活疫苗(HB-98株)的分子特性与免疫效果分析

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是危害全球养猪业最严重的急性传染病之一。猪伪狂犬病的临床症状主要表现在:(1)母猪流产、产死胎、木乃伊胎;(2)公猪感染睾丸肿胀、萎缩,失去种用能力;(3)新生     

猪链球菌血清9型菌株分离鉴定及强毒株筛选

为了筛选猪链球菌血清9型(SS9)强毒株并研究其生物学特性,对全国各地发病猪的病料中进行猪链球菌分离培养。通过形态学观察、革兰氏染色镜检、PCR鉴定及血清型分型确定了29株猪链球菌血清9型菌株,分别命名为SS9-1～SS9-29。通过玉米大蜡螟幼虫和Balb/c小鼠对29株猪链球菌血清9型菌株进行初筛和复筛,筛选出2株猪链球菌血清9型强毒株,分别为SS9-20、SS9-22。为进一步了解SS9-22的生物学特性,对其进行生长曲线绘制、毒力基因检测及小鼠致病性试验。结果显示,SS9-22菌株在37℃培养6 h时,菌液密度可达到最高值。毒力基因检测发现SS9-22的毒力基因型为gapdh⁺/sly⁺/fbps⁺/orf2⁺/mrp~﹣/89K~﹣/gdh⁺/epf⁺。SS9-22菌株经腹腔接种Balb/c小鼠,24 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、被毛耸立、运动迟缓、死亡等临床症状,该菌株的LD₅₀为3.2×10⁷CF...     

2017年我国猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解2017年我国猪源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）的流行情况及其耐药情况，利用细菌分离培养和PCR方法分离鉴定Pm，对其荚膜血清型、地区分布和感染方式进行调查，并采用纸片法测定分离株对20种抗菌药物的敏感性。结果显示，从全国6288份临床病料中分离并鉴定出236株Pm，总分离率为3.75%。随机选取55株进行血清型分型，其中A型25株，D型27株，F型1株，未定型2株；分离率最高的省份为广东省（4.97%），其次是河南省（3.69%）和湖北省（3.25%）；感染模式中，Pm单纯感染占比42.80%，混合感染占比57.2%，最常与链球菌和副猪嗜血杆菌共感染，比例分别为28.81%和12.29%。耐药性试验显示，Pm对强力霉素的耐药率高达83.64%，对卡那霉素、庆大霉素、链霉素和阿米卡星等氨基糖苷类药物的耐药率为43.64%～52.73%，对多粘菌素B和氧氟沙星最敏感（耐药率均为1.82%）。本研究表明我国猪群中Pm流行的主要血清型仍然是A型和D型，临床上Pm与其他细菌发生混合感染的情况普遍存在，并且对多种抗生素产生了耐药性。     

猪链球菌3型疫苗候选菌株筛选及3＋9型二价灭活疫苗对小鼠免疫效果评估

【目的】 筛选猪链球菌血清3型疫苗候选菌株,制备猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗并评估其在BALB/c小鼠上的免疫保护效果。【方法】 从发病猪病料中分离猪链球菌血清3型菌株,通过蜡螟幼虫和BALB/c小鼠模型筛选出强毒株作为疫苗候选菌株,并对候选菌株进行生物学特性研究。将筛选得到的3型疫苗候选菌株和前期筛选的9型疫苗候选菌株灭活浓缩,使其抗原浓度为2×10¹⁰ CFU/mL,无菌检测后将浓缩抗原液按1：1配比混合,再混合抗原与Summit Poly Solution佐剂按4：1比例混合,制备猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗,疫苗中猪链球菌血清3和9型含菌量均为2×10⁹ CFU/mL。将制备的疫苗免疫6周龄BALB/c小鼠,首免后第14天进行二免,二免后第14天进行攻毒。同时设立商品化疫苗免疫组和阴性对照组,评估疫苗的安全性和免疫保护效果。【结果】 PCR鉴定结果显示,23株临床分离株均为血清3型猪链球菌,依次命名为KQ3-1~KQ3-23。分别通过蜡螟和小鼠进行初筛和复筛,筛选到强毒株KQ3-1。毒力基因检测显示,该菌株基因型为gapdh^＋/sly^＋/fbps^-/orf2^-/mrp^-/89K^-/gdh^＋/epf^-;生长曲线显示,该菌株在37 ℃培养8~10 h时生长达到对数生长后期;BALB/c小鼠致病性结果显示,腹腔接种12 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、毛发耸立、运动迟缓、死亡等临床症状,该菌株的LD₅₀为5.2×10⁷ CFU/只。制备的疫苗免疫小鼠后,小鼠精神状况、采食等均正常,疫苗注射部位无肿胀、硬块等不良反应,无死亡发生,表明该疫苗具有良好的安全性。免疫后进行猪链球菌血清2型菌株ZYS、猪链球菌血清3型菌株KQ3-1和猪链球菌血清9型菌株YT攻毒,对照组死亡率分别为90%、100%和100%,猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗免疫组保护率分别为30%、80%和70%,商品化疫苗组的保护效果分别为70%、0和10%。【结论】 本研究研制的疫苗能对猪链球菌血清3和9型强毒株提供良好的免疫保护,该疫苗具备疫苗市场开发的潜在价值。     

猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在建立一种针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重PCR检测方法.对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、沙门菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌基因组模板进行PCR特异性检测,没有任何非特异性扩增.敏感性试验显示,建立的PCR检测方法能够检测到的PCV2和Mhp模板的最低浓度分别为130和180fg·mL-1.同时用单项PCR和双重PCR对湖北省的各大猪场的174份PRDC样品进行检测,PCV2和Mhp的符合率分别达到100％和98.28％.进一步应用双重PCR调查PCV2和Mhp在不同猪场的感染动态,结果显示有一定比例的仔猪在产房就已经感染PCV2和Mhp,大部分猪是在保育和育肥阶段被感染 ;但是不同猪场表现出不同的感染动态.本试验建立了一种针对PCV2和Mhp的双重PCR检测方法,具有良好的特异性、敏感性,为临床疾病检测和疾病流行态势调查提供了有力的支持.     

当前新发伪狂犬病的分子流行特点及防控方案

猪伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种急性传染病,主要以种猪繁殖障碍、新生仔猪急性死亡、断奶-育肥猪莫名发热和呼吸道症状为主要临床表现,已成为猪场重点防控的病毒性传染病。20世纪80年代,该病在我国大面积暴发流行,给国内养殖业带来严重损失。随着伪狂犬病疫苗的广泛应用,该病得到了很好的控制,在国内一直处于平息状态。但自2011年以来,猪伪狂犬病卷土重来,先后在全国不同地区暴发流行,引起了业界的广泛关注和深刻反思。"伪狂犬病毒是否发生变异或毒力增强"、"猪伪狂犬病防控方案是否出现漏洞"、"传统疫苗还能不能提供有效保护"等种种猜测一直在业内流传,笔者所在实验室近年来进行了大量的研究,并相继从临床分离到三十多株伪狂犬病新变异毒株,一些研究结果和数据分析或许为猪伪狂犬病疫情再发找到了佐证。针对猪伪狂犬病流行新形势和发病新特点,结合临床疫情处理和成功防控案例,及时调整免疫策略,探寻一种更为有效的伪狂犬病免疫方案,在当前变异伪狂犬病阳性感染场或受威胁场推广应用中显得尤为重要。     

猪群高热病的防控

1高热病的突出临床问题1.1高热病的突出问题莫名发热(40℃～41℃),全身皮肤发红,食欲废绝,尖端效应或全身败血,多系统衰竭(淋巴结、肺、心脏),传播速度快、成活率低(50%～85%)。1.2高热病的突出临床病变淋巴结:全身淋巴结不同程度充血、水肿,色灰白、灰红或暗红,腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结最     

猪库布病毒RT-PCR检测方法的建立及湖北省流行病学初步调查

根据猪库布病毒的3 D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3 D基因和口蹄疫病毒3 D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测。敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL。应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性。在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示,猪库布病毒在猪群中集中分布在发生腹泻疫情的猪群,说明猪库布病毒和现阶段的腹泻疫情有紧密的联系。     

2015—2017年我国部分地区猪乙型脑炎血清抗体监测

为了解我国猪乙型脑炎的免疫效果,采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）,对来自全国部分地区529家猪场的10 991份猪血清样品进行乙型脑炎血清抗体检测,并对检测结果进行时间、空间和群间分布分析。结果显示：2015—2017年乙型脑炎平均抗体阳性率分别为89.86%、83.79%和89.89%,总阳性率为88.39%;春季（3月—5月）抗体水平较低,平均阳性率为78.69%,冬季（12月—次年2月）抗体水平最高,平均阳性率为91.24%;西南地区抗体阳性率最低,为80.09%,华东地区最高,为93.57%;经产母猪和公猪抗体水平最高,阳性率分别为95.61%和92.11%,商品猪阳性率最低,为41.38%。结果表明,我国猪群乙型脑炎疫苗免疫水平整体情况较好,但春季、商品猪群以及部分猪场的抗体水平偏低,需要加强监测,及时进行疫苗免疫。     

牛结节性皮肤病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立

为建立高效检测牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的血清学方法,本研究设计优化LSDV RNA聚合酶30亚基(RPO30)蛋白的密码子,构建其原核表达质粒pET-25b-RPO30,并进行诱导表达和阴离子纯化。纯化后的RPO30蛋白可以被LSDV的阳性血清识别,具有良好的反应原性。用纯化的RPO30蛋白免疫BALB/c小鼠,并将免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,筛选到能够稳定分泌抗体且具有竞争效果的杂交瘤细胞株1H1。以重组RPO30蛋白为包被抗原,经反应条件的优化,建立了基于RPO30蛋白的竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。本研究建立的cELISA检测方法的最适抗原包被质量浓度为1 mg/L,用含5%牛血清白蛋白(BSA)的PBST作为封闭液37℃孵育2 h,待测血清的最适稀释度为1∶2,1H1抗体稀释度为1∶2 000,兔抗鼠HRP-IgG稀释度为1∶4 000,最佳显色条件是37℃反应15 min。当检测样品的1-S/P≥0.55,判定结果为阳性;当检测样品的1-S/P<0.55,判定结果为阴性。利用...