猪miR-124靶向IQGAP2调节巨噬细胞内沙门氏菌的增殖

[目的]明确猪miR-124与其靶基因IQGAP2间的表达调控关系,以及miR-124表达水平与猪巨噬细胞内沙门氏菌数量的关联,为揭示沙门氏菌在感染细胞内存活与增殖的机制提供理论依据.[方法]通过荧光素酶报告基因系统验证miR-124与IQGAP2基因的作用位点;再以GM-CSF诱导的猪巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)为试验材料,通过实时荧光定量PCR和流式细胞术测定沙门氏菌感染猪巨噬细胞中miR-124和IQGAP2基因的表达及巨噬细胞内沙门氏菌的增殖情况.[结果]miR-124结合位点野生型载体转染的荧光报告信号显著低于miR-124结合位点突变载体(P<0.05,下同),但共转染anti-miR-124序列后能显著增强miR-124结合位点野生型载体的荧光报告信号.经沙门氏菌感染后,猪巨噬细胞中的miR-124表达被激活,感染12、24和48 h后的相对表达量均显著高于沙门氏菌感染前(0 h),而IQGAP2基因表达水平呈显著下调趋势;在沙门氏菌感染猪巨噬细胞内,miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平呈明显负相关(r=-0.92).miR-124高表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞,但miR-124敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著低于正常巨噬细胞;IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞;此外,miR-124高表达+IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量与IQGAP2基因敲低表达处理组相比无显著差异(P>0.05),但显著高于miR-124高表达组细胞.[结论]沙门氏菌感染猪巨噬细胞中的miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平及胞内沙门氏菌数量呈负相关,即沙门氏菌可通过上调miR-124表达靶向抑制IQGAP2基因表达,从而调节其在猪巨噬细胞内的增殖.     

几种除草剂防除秧田杂草的效果

我县由于长期单一使用除草醚进行秧田化除,致使杂草产生了抗性,防效逐年下降,稗草等杂草发生严重。为解决秧田草害,1991年选择了一些新型、高效、广谱的除草剂进行化除试验。一、材料与方法(一)试验田基本情况:试验田面积2.8亩,品种为8169-22,不浸种催芽,5月15日播种,秧板为通气式,平整,每亩播种35千克,均匀一致。土壤保水性能好,排灌方便,肥力     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白保守区的表达与鉴定

根据发表的犬瘟热病毒基因序列设计一对引物,利用PCR方法从重组质粒pcDNA-N中扩增到CDVNP保守区基因片段,并按预定的阅读框架插入表达质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶（GST）基因的下游,获得重组质粒pNP-CDV并转化大肠杆菌BL21。序列测定表明,克隆到的基因片段大小为1065bp,与已发表的毒株核衣壳蛋白基因序列具有很高的同源性。通过对茵体裂解物的SDS．PAGE、Western blot鉴定以及IFA试验,证明携带重组质粒pNP-CDV的大肠杆菌的可以表达融合蛋白形式的核衣壳蛋白保守区域（命名为GST-NP,分子量约为64ku）,该融合蛋白具有免疫原性和对CDV高免血清的反应活性。GST-NP的表达,将为临床检测CDV抗体提供诊断抗原。     

犬细小病毒分离株VP2基因的克隆与序列分析

以犬细小病毒 (Canine parvovirus,CPV)扬州分离株病毒的 DNA为模板 ,根据基因库 CPV-d序列设计合成了VP2基因的 1对特异引物 ,进行聚合酶链式反应 ,扩增出约 1 .7kb的片段 ,按常规方法克隆进 p UC1 8载体 ,经 Eco R 和Sal 双酶切筛选到阳性质粒 ,进一步对该片段进行序列分析。结果表明 :所扩增基因片段长度为 1 740 bp,与美国参考株 CPV-d (type 2 )、CPV-1 5 (type 2 a)、CPV-3 9(type 2 b)相比较 ,核苷酸同源性分别高达 99.5 %、99.7%、99.7%。     

肝螺杆菌CdtB基因缺失株的构建与验证

试验旨在敲除肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus,H.hepaticus）的CdtB基因,采用pcDNA质粒构建自杀质粒,用于敲除肝螺杆菌ATCC 51449菌株CdtB基因。根据同源重组原理,通过电击转化方法将质粒转入肝螺杆菌构建肝螺杆菌CdtB基因缺失株（ΔCdtB）。采用PCR及测序技术对ΔCdtB缺失株进行鉴定。采用生化试验、生长曲线测定检测ΔCdtB缺失株与野生型肝螺杆菌区别。结果显示,获得以质粒pcDNA构建的同源重组敲除质粒pcDNA-ΔCdtB,电击转化肝螺杆菌后经过传代筛选可获得氯霉素阳性转化子。缺失株替换片段的PCR产物为964 bp,大于野生型肝螺杆菌对应产物884 bp,测序结果表明,氯霉素抗性基因已替换了CdtB基因。比较发现,ΔCdtB缺失株与野生型菌株的尿素酶试验结果均呈阳性,并且在生长速率方面与普通血琼脂平板上无显著差异,但最终缺失株在含氯霉素的血琼脂平板上生长更多。除此之外,将获得的缺失株持续传代并进行PCR鉴定未发现回复突变,有较好的遗传稳定性。综上所述,本研究构建的基因敲除质粒pcDNA-ΔCdtB实现了对肝螺杆菌中目标基因的敲除,为肝螺杆菌基因功能研究和致病因子的发掘提供了有效的基因操作工具。     

鸡白痢沙门菌ssaV基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为探究ssaV基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,利用同源重组技术,以pKD3质粒为模板,设计同源臂,扩增外源线性DNA片段,将该片段电转化入含有pKD46的鸡白痢沙门菌C79-13,丢失pKD46后,获得重组菌C79-13ΔssaV::Cm,将pCP20导入该重组菌,通过筛选获得ssaV基因缺失株C79-13ΔssaV,同时构建其回补株C79-13ΔssaV(pBR322-ssaV),并对突变株C79-13ΔssaV的生长特性和生化特性、遗传稳定性及毒力等基本生物学特征进行分析.PCR扩增和测序结果显示,成功构建了缺失株C79-13Δssa V,野生株 C79-13、缺失株 C79-13Δssa V 和回补株 C79-13ΔssaV(pBR322-ssa V)呈现出一致的生长特性和生化特性,突变株C79-13ΔssaV的遗传稳定性良好,其在雏鸡体内的定殖能力降低,且口服攻毒后,缺失株C79-13ΔssaV对雏鸡半数致死量(LD50)至少是野生株(C79-13)的100倍.以上结果表明,sssaV基因与鸡白痢沙门菌的致病性相关,其缺失会明显降低鸡白痢沙门菌的毒力.     

犬细小病毒YZ分离株的鉴定

对1999年冬季江苏省实验动物Beagle犬基地暴发的以拉稀、便血、高死亡率的病犬作流行病学调查、病理和实验室诊断。粪便血凝价高达2^14以上，并用HI加以验证，初步诊断为犬细小病毒感染引起的出血性肠炎。用FK81细胞（胎猎肾传代细胞）分离病毒，细胞上清HA试验阳性；负染电镜观察到在小为20nm左右的病毒粒子；接种病料的细胞IFA检测可见特异性的亮绿色荧光。在小肠的病理切片中见到典型的嗜酸性核内包涵体。以此确诊为犬细小病毒感染引起的出血性肠炎。利用双琼脂空斑技术克隆一株犬细小病毒，命名为CPV－YZ株，其核酸型是单链DNA，对甲醛敏感，对氯仿、酸、胰蛋白酶不敏感，80℃ 60分钟失去活力，0．1ml TCID50是10^-6.8,SDS-PAGE电泳两条清晰的条带分别为：76kD的VP1，64kD的VP2。     

小鼠白细胞介素2基因克隆及其逆转录病毒载体的构建

从小鼠脾脏淋巴细胞中抽提总RNA,应用RT-PCR技术扩增出mIL-2基因,按常规方法构建T载体,然后克隆、酶切鉴定、测序分析;通过双酶切将该基因片段接入逆转录病毒载体pGEZ-Term中,脂质体法共转染包装细胞293T;用含病毒颗粒的293T细胞上清液感染L929细胞,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达抗性的L929细胞株,并通过RT-PCR技术检测到转基因L929细胞株中mIL-2基因的转录,表明成功构建了含mIL-2基因的重组逆转录病毒载体并筛选出整合有mIL-2基因的细胞株。     

含砷鸡粪施肥后对青菜和番茄植株中砷富集的影响

利用给鸡饲喂50mg·kg-1和80mg·kg-1洛克沙生得到的鸡粪进行盆栽试验,研究两种含砷鸡粪对青菜和番茄中砷含量、砷富集因子的影响。结果表明,含砷鸡粪施肥后青菜和番茄植株中砷含量均明显提高;青菜砷含量、砷富集因子高于番茄植株,青菜有明显的砷富集作用;番茄植株中砷含量与其生物量呈负相关、未表现出对砷的富集作用。不同种属蔬菜在含砷鸡粪施肥后对砷有不同的摄入,青菜对砷有明显的富集现象,提示青菜在含砷鸡粪施肥后砷水平有较大影响,存在着砷超标风险。