L.reuteri亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达及活性检测

以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21为表达宿主，重组表达亚油酸异构酶(gLI)。根据GenBank上发表的gLI基因序列，设计并合成一对引物，从L.reuteriPYR8基因组中，PCR扩增出去除5’端42bp信号肽的gLI基因片断，将其克隆入pMD－18－T载体中，序列测定后将gLI基因亚克隆到表达载体pET30a中（pET30a-gLI），将其转化大肠杆菌BL21(DE3)， 在1mmol/L IPTG 30℃条件下诱导表达，大肠杆菌裂解物经SDS-PAGE分析，出现了一新分子量约67kD的蛋白带，与预期目的蛋白分子量相符。生物学活性鉴定表明：经稀释、透析复性，获得的重组gLI在反应缓冲液可以将亚油酸（LA）转化为共轭亚油酸（CLA），30℃ pH7.3的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，酶活最高为1377U。为进一步体外研究gLI的生物学活性、酶作用机制奠定了基础。     

淫羊藿—蜂胶合剂对雏鸡细胞免疫功能的影响

３日龄雏鸡皮下注射淫羊藿－蜂胶合剂，于７，２１，３５，４９日龄分别采用微量全血＾３Ｈ－胸腺嘧啶核苷掺入法和乳酸脱氢酸（ＬＤＨ）释放法测定雏鸡外周血Ｔ淋巴细胞转化率和自然杀伤细胞（ＮＫ）活力。注射剂量０．４ｍｌ／羽能极显著地提高２１日龄和３５日龄雏鸡Ｔ淋巴细胞转化率和３５日龄雏鸡ＮＫ活力。０．２ｍｌ／羽与０．４ｍｌ／羽作用相似。０．４ｍｌ／羽效果优于０．２ｍｌ／羽，结果表明，淫羊藿－蜂胶合剂能发挥名     

我国禽流感防制研究进展

禽流行性感冒 (简称禽流感 ,avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病 ,被国际兽疫局定为A类传染病 ,并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。禽流感可表现为亚临床、轻度呼吸系统疾病、产蛋下降及急性致死性疾病等多种形式。世界各地历次由特定毒株引起的禽流感的暴发和流行 ,均招致禽只的大量死亡和生产性能急剧下降 ,造成了巨大的经济损失 [1 ] 。 1 997年香港H5N1和 1 999年内地和香港 H9N2禽流感感染人事件的发生 ,更突出地显示了禽流感的公共卫生意义。我国禽流感研究开展得较晚。自 80年代起始有禽流感病毒…     

5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103.该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段.     

跨膜丝氨酸蛋白酶-4对2009甲型H1N1流感病毒HA的切割及其融合活性研究

流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤.2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化.本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸蛋白酶4 (TMPRSS4)的真核表达重组质粒pCA-TMPRSS4-Flag与表达2009甲型H1N1流感病毒中国四川分离株HA的真核重组表达质粒pCA-SCHA共转染293T细胞,利用westernblot证明2009甲型H1N1流感病毒的HA蛋白能够被TMPRSS4切割;通过激光共聚焦确定TMPRSS4和HA在293T细胞膜上共定位;并进一步通过细胞融合试验证明经正确切割的HA具有在低pH条件下介导细胞膜发生融合的生物学功能.本实验为研究自然感染情况下参与活化流感病毒的宿主胰蛋白酶提供了实验依据.     

表达鸡传染性支气管炎病毒S基因的重组新城疫病毒构建

为构建以新城疫病毒(NDV)为活毒载体表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S基因的重组病毒,本研究利用RT-PCR技术,以IBV的Massachusetts41株RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到IBV S基因(3534bp),将其插入到NDV感染性克隆pBRN-FL中,构建了含有IBV S基因的重组NDV cDNA克隆pBRN-FL-IBVS。利用磷酸钙转染法,在辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L的共同作用下,将pBRN-FL-IBVS转染表达T7聚合酶重组痘病毒感染的BSR细胞,救获重组NDV(rL-IBVS)。采用RT-PCR检测接种重组病毒的鸡胚尿囊液,结果表明rL-IBVS中含有相应外源基因。IFA试验表明,rL-IBVS可与鸡抗IBV的高免血清发生特异性反应,证明S蛋白在感染的BSR细胞中得到表达。其鸡胚平均致死时间、脑内致病指数和静脉内致病指数等指标显示rL-IBVS保持了亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病力特性。本研究采用反向遗传操作技术构建了表达IBV S蛋白的重组NDV,为进一步研制IBV和NDV的重组基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强株VP2基因重组新城疫病毒胚胎免疫安全性及效力试验

为研制能够同时预防传染性法氏囊病(IBD)和新城疫(ND)的疫苗,本研究选用表达IBD病毒(IBDV)超强毒株(vvIBDV)VP2基因的重组ND病毒(NDV)LaSota疫苗株(rL-VP2),测定其半数鸡胚感染量、平均鸡胚致死时间、脑内接种指数和静脉内致病指数等指标,按不同剂量接种18胚龄SPF鸡胚,分别于出雏后第9d、第14d和第21d采血,用微量凝集法和ELISA方法测定血清中抗NDV抗体和抗IBDV抗体水平,并于出雏后28d用NDV强毒(F48E9株)和vvIBDVGx株攻毒,评估重组疫苗的胚胎免疫效果。结果显示:按104EID50/枚剂量进行免疫不会影响SPF鸡胚出雏率和出雏后21d存活率,并且该免疫组雏鸡能够对NDV强毒和vvIBDV攻毒提供安全的免疫保护。     

H5亚型高致病性禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗接种后气管黏膜损伤的研究

为了研究H5亚型高致病性禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗[rLa Sota-HA(GD)]的免疫机理,用rLa Sota-HA(GD)免疫2日龄SPF雏鸡,分别在接种后的1,3,5,10,15,18天取气管进行电镜、光镜观察,利用免疫组化染色(IHC)方法检测病毒在气管内的分布。结果表明:接种rLa Sota-HA(GD)后第1天纤毛细胞有脱纤毛现象,杯状细胞破碎,黏液成分增多,黏膜下层的纤维裸露在表面上,并可看到纤毛细胞的纤毛上有球形粒子,杯状细胞、基细胞大量增生;接种后第18天纤毛细胞脱纤毛区域进一步增大。接种后第3天黏膜下层水肿,淋巴细胞、粒细胞、浆细胞浸润,黏膜上皮形成空泡状,表层由数层不成熟的细胞组成;接种后第10天腺体腔闭塞。免疫组化染色可见气管固有层细胞呈阳性反应,棕色颗粒出现在胞浆中。结果说明气管黏膜的损伤是机体重要的防御机制和免疫机制的表现。     

以rLaSota为骨架构建表达强毒株HN蛋白的嵌合体新城疫病毒

新城疫病毒(NDV)的HN蛋白是一个多功能蛋白,具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性,在病毒感染过程中扮演重要角色。本研究利用反向遗传操作技术,将NDV强毒株F48E9的HN基因替换弱毒株rLaSota的HN基因,获得嵌合病毒rL-F48E9HN。收获病毒尿囊液,提取基因组RNA,进行序列分析,结果显示嵌合病毒基因组的HN基因获得了正确替换。嵌合病毒在鸡胚内的生长特性与亲本株LaSota一致,与F48E9的生长特性相差甚远。嵌合病毒红细胞吸附性明显增强,较rLaSota株增加51%,而细胞融合作用无明显变化。rL-F48E9HN的鸡胚平均致死时间(MDT)为148 h,脑内致病指数(ICPI)为0.43,静脉接种致病指数(IVPI)为0,说明rL-F48E9HN的毒力仍然属于弱毒力范围,而没有达到中等毒力或者强毒力。     

抗乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体5D4重链可变区基因的克隆及序列分析

流行性乙型脑炎(JE)简称乙脑,是由乙型脑炎病毒引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病.多种动物易感,蚊是JEV 的主要传播媒介,猪是该病毒在自然界中最重要的贮存与增殖宿主,母猪感染可引起繁殖障碍,给养猪业造成巨大的经济损失.JEV主要在亚洲流行,而最近发现在南半球也有报道,这说明流行性乙型脑炎可能在世界范围内威胁着人类健康[1].JEV属黄病毒科黄病毒属,为单股正链、有囊膜的RNA病毒.