鸡IFN-γ DNA壳聚糖纳米粒的制备及外源基因表达

为检测纳米载体对表达重组质粒的保护效果,本实验构建了鸡γ干扰素(IFN-γ)真核表达重组质粒pCAGGS-ChIFN-γ;并将其与200μg/mL壳聚糖醋酸溶液制备成DNA/壳聚糖纳米颗粒(CNPs)。透射电镜观察CNPs呈不规则球形,光子相关色谱(PCS)仪测定显示CNPs的平均粒径为172.6nm±5.1nm;Zeta电位为20.8mV±2.9mV;CNPs重组质粒包埋效率和载药量分别为91.21%±2.54%和31.93%±0.16%。鸡胚成纤维细胞(CEF)体外转染实验表明:携带的外源基因能在CEF中释放、表达,其表达效率约为阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000转染后的16.3%,同时CNPs对细胞基本无毒性。CNPs稳定实验也证实其稳定性良好。     

表达水疱性口炎病毒G基因重组新城疫病毒的构建及免疫原性研究

水疱性口炎是由水疱性口炎病毒(VSV)引起的人兽共患性传染病,在我国尚无可用疫苗。为研制安全有效的水疱性口炎疫苗,本研究以新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统为基础,构建并拯救出表达VSV糖蛋白(GP)的重组病毒(rLa-VSV-G)。间接免疫荧光、激光共聚焦、western blot等试验证明VSV-GP在重组病毒中正确表达;体外致病试验结果表明,rLa-VSV-G保持了LaSota亲本株的低致病性和高滴度的鸡胚生长特性;rLa-VSV-G接种4周龄~5周龄BALB/c雌性小鼠后,可以诱导显著的VSV中和抗体反应。本研究表明,重组病毒rLa-VSV-G具有作为防控VSV储备性疫苗的潜力。     

Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达与活性检测

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,亚克隆到pET30a中构建原核表达载体pET30a-LI,并转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。其重组菌株在37℃条件下,经1.0mmol/L IPTG诱导表达重组LI蛋白,该蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的39.2%。采用Ni2 -NTA柱上复性法获得有活性的纯化重组亚油酸异构酶,其比活力5.12U/mg,是天然亚油酸异构酶比活力的2.5倍。     

犬瘟热病毒融合蛋白、血凝蛋白、基质蛋白和核衣壳蛋白基因DNA联合免疫的研究

为研究犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)、基质膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)基因核酸联合免疫的效力,本研究分别构建了表达经哺乳动物密码子优化的CDV F、H、M和N蛋白基因的真核重组表达质粒p CAGG-CDVF、p CAGG-CDVH、p CAGG-CDVM和p CAGG-CDVN;将其分别转染BHK-21细胞后通过间接免疫荧光试验表明,目的蛋白均获得正确表达。此外,将等量混合的重组质粒p CAGG-CDVF、p CAGG-CDVH、p CAGG-CDVM(3组份DNA疫苗)或重组质粒p CAGG-CDVF、p CAGG-CDVH、p CAGG-CDVM、p CAGG-CDVN(4组份DNA疫苗),分别以500μg/只经肌肉注射途径免疫A组(6只)或B组(6只)比格犬,间隔4周以相同剂量、途径加强免疫一次,并于初次免疫前、后不同时间检测血清CDV中和抗体。中和试验结果显示,A组和B组免疫犬,二免4周时,CDV中和抗体滴度平均值达到峰值,分别为6 log2和5.64 log2;在初免54周时,CDV中和抗体滴度均仍然维持5 log2。因此,3组份DNA疫苗为具有良好应用前景的犬瘟热候选疫苗。     

传染性支气管炎病毒我国地方分离株病原性和基因分型的比较研究

对来自国内部分地区的６个分离株及３个参考株,以蛋白酶Ｋ－ＳＤＳ法提取其基因组ＲＮＡ,经反转录－聚合酶链式反应扩增了预期的１．７ｋｂ纤糖蛋白Ｓ１基因ｃＤＮＡ。     

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡-γ-干扰素（Chicken interferon-γ，ChIFN-γ）的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光（1FA）及间接ELISA检测，表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示，重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制。而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明，重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ，并具有高效抗病毒活性。     

重组痘病毒表达裂谷热病毒囊膜蛋白及其免疫原性分析

裂谷热(Rift valley fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift valley fever virus,RVFV)引起的烈性人畜共患传染病。囊膜糖蛋白G是病毒的主要结构蛋白,由基因组M节段编码,翻译后裂解为Gn和Gc,其中Gn为诱导中和抗体的主要免疫原。本研究分别构建了表达RVFV囊膜蛋白G(n c)和Gn的重组痘病毒rVV-G (n c)和rVV-Gn。SDS-PAGE、Western blot结果表明分子量分别为56 Ku(Gn)、58 Ku(Gc)左右的重组蛋白在rVV-G(n c)和rVV-Gn哺乳动物细胞获得准确表达[G(n c)裂解为Gn和Gc],并具有特异免疫反应原性。以rBac-G(n c)和rBac-Gn感染的昆虫细胞裂解物为包被抗原,间接ELISA检测血清抗体结果显示,rVV-G (n c)和rVV-Gn免疫小鼠可诱导显著的Gn、Gc特异抗体反应,并且rVV-G(n c)免疫诱导主要保护性免疫原Gn特异抗体反应效果优于rVV-Gn。结果表明,表达全长囊膜糖蛋白重组痘病毒rG(n c)具有作为安全有效的重组病毒活载体疫苗的潜力,为RVF重组亚单位疫苗的探索研究奠定了基础。     

Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在毕赤酵母中的表达

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,将其克隆至酵母表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115中.重组菌株GS115/pPIC9K-LI经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳表明该基因在酵母中得到表达,即分子量约为67 kD的重组LI蛋白.经SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析纯化获得了纯度为95%的重组LI蛋白样品.气相色谱分析表明,纯化的重组LI具有亚油酸异构酶的活性,酶的比活力为6.8 U·mg-1.     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株感染性分子克隆的构建

 【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）拯救平台，为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDV Gt株全基因组中引入分子标签（A节段：EcoR V酶切位点；B节段：PstI酶切位点）。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构（HamRz）和丁肝病毒核酶结构（HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游，构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，LipofectamineTM2000介导共转染DFI细胞，进行病毒拯救研究。 【结果】 构建的IBDV感染性克隆可在DFI、Vero/E6、Vero/P12等3种细胞上高效拯救出病毒。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV，且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE，且TCID50与亲本毒差异不显著，具有相似的生物学特征。【结论】构建的RNA聚合酶ⅢBDV拯救系统高效、稳定、简便、经济，且具有良好的细胞普适性。     

新城疫病毒接种后气管黏膜损伤研究

为了研究新城疫弱毒疫苗的免疫机理,用rlasota(重组lasota野毒株)免疫2日龄SPF雏鸡,接种后分别在第1,3,5,7,15,18 d取气管,进行电镜、光镜观察,利用免疫组化染色方法检测病毒在气管内的分布;结果发现rlasota接种后第1 d纤毛细胞有脱纤毛现象。接种第3 d杯状细胞破碎,黏液成分增多,黏膜下层的纤维裸露到表面;接种后第7 d,可以看到纤毛细胞纤毛上有球形粒子,杯状细胞、基细胞大量增生;接种后第18 d,纤毛细胞脱纤毛区域进一步增大。光镜观察结果发现,接种后第5 d黏膜下层水肿,淋巴细胞、粒细胞、浆细胞浸润,黏膜上皮形成空泡状,表层有数层不成熟的细胞组成;接种后第7 d,腺体腔闭塞。免疫组化染色气管固有层细胞呈阳性反应,棕色颗粒出现在胞浆中。这说明气管黏膜的损伤可能是机体重要的防御机制和免疫机制的表现。