表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究

为确定狂犬病病毒(RV)Flury-LEP株外源基因的插入位点及其中和抗体快速检测方法,本研究在建立了RVFlury-LEP株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组LEP基因组cDNA克隆pCI-LEP-EGFP,并成功拯救出重组病毒(rLEP-EGFP)。rLEP-EGFP的生物学特性和野生型LEP(wtLEP)在NA细胞和BHK-21细胞中的生长动力学及对小鼠的致病性没有显著差异。rLEP-EGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,各代次重组病毒均稳定表达EGFP。重组表达的EGFP可用于中和抗体检测,rLEP-EGFP免疫犬血清经间接免疫荧光(IFA)或荧光下直接观察检测RV中和抗体滴度,两种检测结果显示较好的相似性(p0.05)。本研究为研制以Flury-LEP株活载体多价疫苗奠定了基础,并为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

传染性支气近炎病毒类M41地方分离株S1基因克隆及高变区序列分析

传染性支的管炎病毒（ＩＢＶ）分离株ＱＤ经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出约１．７ｋｂＳ１糖蛋白基因ｃＤＮＡ，修饰后插入ｐＵＣ１８ＳｍａｌⅠ／ＥｃｏＲＩ位点构成质粒ｐＵＣＱＤＳ１。对克隆的Ｓ１基因５′端高变区序列测定显示，起始密码上游６０碱基和下游３８０碱基中与参考株Ｍ４１Ｓ１基因序列仅有１个碱基的差异，表明ＱＤ为一类Ｍ４１分离株。     

水貂阿留申病导致繁殖失败的研究报告

<正> 江苏省某大型水貂场,在近十余年间,除了1980和1986年两次遭受水貂犬瘟热病的严重危害而更新貂群外,其他年份的胎平均成活均在3.5只上下,经济效益较好。该场在饲养管理上有一定经验,但在疫病防制上却存在很大的缺陷。1987年在更新的貂群中发生大批流产(吸收、死胎和弱仔等)造成了巨大损失。经调查研究证明,其原因是阿留申病所致。一、流行病学调查该场1987年度的新种貂群是由山东引进的156只公貂、辽宁引进的450只母貂、     

表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒印第安纳株的构建

通过负链RNA病毒反向遗传操作技术,成功救获了表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组印地安纳株水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus Indiana serotype)、救获的重组病毒保持了野生型VSV高滴度生长特性,细胞连续传代10次仍保持GFP的稳定表达及生物学特性不变。本研究为VSV作为新型重组活病毒载体疫苗和肿瘤治疗载体研制及基础病毒学相关研究提供了理想的技术平台。     

抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的制备及定量ELISA方法的建立

将原核表达重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)以100μg/只剂量免疫8周龄BALB/c小鼠,4次免疫后进行细胞融合,以昆虫细胞表达重组鸡γ-干扰素为检测抗原,筛选出阳性克隆株,经有限稀释,获得1株稳定分泌抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分泌抗体亚型为IgG1型,轻链为Κ链,命名为G1株。Western blot检测显示,该单克隆抗体与原核表达和昆虫细胞表达的rChIFN-γ均具有良好的免疫反应原性。昆虫细胞表达rChIFN-γ经该G1单克隆抗体作用后,失去抑制水疱性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)复制的能力。利用纯化的单克隆抗体和昆虫细胞表达rChIFN-γ建立相对定量ELISA检测方法,取吸光度值(Y)对昆虫细胞表达rChIFN-γ的抗病毒活性单位对数(X)作回归曲线,回归方程为Y=0.1164~*X-0.1281,回归系数R=0.9539,具有艮好的线性关系。     

重组杆状病毒表达裂谷热囊膜蛋白的研究

裂谷热（Rift valley fever，RVF）是由裂谷热病毒（RVFV）引起的烈性人兽共患传染病。囊膜糖蛋白G是病毒的主要结构蛋白，由基因组M节段编码，翻译后裂解为GN和GC，其中GN为诱导中和抗体的主要免疫原。本研究构建了分别表达RVFV囊膜蛋白G（N＋C）、GN及GC的重组杆状病毒rBac—GCN＋C、rBac-GN及rBac-GC。SDS-PAGE、Western-Blot表明分子量分别为56Ku、58Ku左右的重组GN和GC在rBac—GCN＋C、rBac-GN及rBac-GC感染sf9昆虫细胞中获得表达，并具有特异免疫反应原性。以rBac—GN、rBac—GC和rBac—G（N＋C）感染的昆虫细胞裂解物稀释后直接包被ELISA板，检测灭活RVFV免疫小鼠血清特异囊膜蛋白GN、GC特异抗体，显示出高度敏感性和特异性。结果表明，杆状病毒表达rGN、rGC和rG（N＋c）具有替代RVFV全病毒（尤其是rGN），作为非疫区安全、敏感和特异的诊断抗原的潜力，并为RvF重组亚单位疫苗的探索研究奠定了基础。     

表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

【目的】将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS，构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5，以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。【方法】将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白，随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100 ?g和10 ?g剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后用100 LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。【结果】间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白，载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI；免疫SPF鸡后，100?g pCAGGHA5可形成5/5的免疫保护，100?g pCIHA5可形成2/4的免疫保护，10?g pCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护，而10?g pCIHA5 则基本不能形成免疫保护，pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。【结论】鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。     

重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究

为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(rLa-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(Cap△41)的重组病毒(rLa-PCV2/Cap△41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测.通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的Cap△41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的Cap△41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础.     

表达小反刍兽疫病毒F蛋白的重组山羊痘病毒疫苗的研究

本研究利用gpt筛选基因和eGFP报告基因纯化筛选重组小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-F),并经过PCR鉴定.免疫荧光和蛋白印迹试验都证实重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞并表达PPRV F蛋白.以2×106PFU的rGPV-PPRV-F皮内注射免疫山羊3只,并于首次免疫后第28 d以相同剂量进行二次免疫.分别于一免后21 d和二免后14 d采血后分离血清进行病毒中和试验.结果表明,一免后21 d山羊痘病毒(GPV)中和抗体效价依次为1:40、≥1:80、≥1:80,PPRV中和抗体效价依次别为1:20、1:40、1:20,全部阳转;二免后14 d,GPV中和抗体效价≥1:80,PPRV中和抗体效价依次为1:20、1:80、1:40.本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化奠定了基础.