仔猪大肠杆菌·C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺

[目的]研究仔猪大肠杆菌、C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺。[方法]分别试验不同的培养时间、培养温度和接种剂量对大肠杆菌纤毛表达量和C型产气荚膜梭菌产生毒素的影响。[结果]大肠杆菌在接种剂量为3%～5%,在36～37℃条件下培养7 h,可产生较高含量的纤毛抗原;当接种剂量为1%～2%,C型产气荚膜梭菌C59-2菌株在35℃条件下培养16～20 h,可产生大量致死性毒素。[结论]该研究为研制具有较好效果的仔猪红痢、黄痢预防疫苗提供了依据。     

湖北省奶牛疾病防控体系建设现状及思考

<正>发展奶业是关系国计民生的大事,党中央和国务院以及各部委高度重视。胡锦涛总书记在视察蒙牛集团时指出:"牛奶是健康食品,不仅小孩要喝,老人要喝,最重要的是中小学生都要喝上牛奶,以提升整个中华民族的身体素质。"国务院总理温家宝指出     

动物源耐氟喹诺酮类药物致病性大肠杆菌gyrA基因的突变研究

用微量稀释法测定盐酸环丙沙星等5种氟喹诺酮类抗菌药物对20株耐氟喹诺酮类药物的动物源致病性大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC),PCR扩增gyrA基因的喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance determining regions,QRDR),扩增的片断长度为496 bp,PCR产物直接测序,用DNAStar软件分析氨基酸序列。结果显示,盐酸环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星和烟酸诺氟沙星的MIC范围分别为64～>512μg/mL、16～256μg/mL、16～128μg/mL、64～>512μg/mL和64～>512μg/mL。gyrA基因的突变位点均位于83和87位氨基酸位点,主要的变异方式为Ser83→Leu(15/20),其次是Asp87→Asn(13/20),其他的为Asp87→Tyr(6/20),Ser83→Trp(4/20),Ser83→Ala(1/20)和Asp87→Gly(1/20)。说明试验用菌株对氟喹诺酮类药物均表现为多重耐药,其gyrA基因QRDR的突变表现为多种形式。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白的表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用

将含有猪胸膜肺炎放线杆菌毒素 基因的质粒 p ET- Apx 转化到大肠杆菌 BL2 1 (DE3)。挑选出表达量最高的克隆子 ,于 37℃经 IPTG诱导表达。对表达条件进行优化 ,并对包涵体进行了提纯和复性。用复性后的蛋白作抗原 ,建立了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接 EL ISA。试验的最佳反应条件为 :最佳抗原稀释度为 1∶ 1 6 0 ,抗原包被液用 Tris- HCl(p H8.0 ) ,封闭液用含 0 .4 %BSA的 PBST,血清稀释度为 1∶ 4 0 ,二抗稀释度为 1∶ 6 0 0 0 ,稀释液用含0 .4 %BSA的 PBST,血清反应时间为 30 min,二抗反应时间为 4 5 min,底物反应时间为 2 0 m in。与间接血凝 (IHA)检测结果比较 ,建立的 EL ISA诊断方法具有良好的稳定性和可重复性 ,并具有较高的特异性和敏感性。用建立的间接EL ISA对 2 5 0 3份临床送检血清进行了血清流行病学调查 ,结果表明 ,胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性率为 6 3%。     

牛支原体p30蛋白的原核表达与鉴定

为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。     

12种猪病血清学调查及病原学检测结果辨析

在湖北省、湖南省、江西省及广西壮族自治区的30个猪场,采集了750份血样、150份病死猪的组织样品,进行了CSF等12种猪病的血清学调查和病原学检测.结果显示,12种疫病中,虽然某些疾病的免疫抗体阳性率较高,但存在不同程度的野毒和致病菌的感染,由于采取了免疫和药物预防措施,某些疾病得到了有效控制.对调查与检测结果进行了分析,并就如何加强这些疫病的防控提出了建议.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5基因的遗传变异与系统进化分析

为进一步了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在国内的分子遗传进化情况,对中国大陆1996～2008年间33株PRRSV分离毒株(29株来自GenBank)的GP5序列与国外部分代表毒株进行了分析比较.结果表明,所选PRRSV中国分离毒株中有32株属于北美洲型(NA),并大致可分为2个基因亚群,1株属于欧洲型(EU).其中,自2006年在我国暴发的高致病性蓝耳病病毒(H-PRRsV)属于亚群1,且与YA株亲缘关系较近;亚群2毒株则与Ingelvac的弱毒疫苗株及其亲本株VR-2332具有较高的同源性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒临床分离株(HBKM2)的ORF5全基因,并进行了测序分析,根据0RF5的结构特点,进一步扩增了截去N端信号肽序列的ORF5(nsORF5),并将其克隆到pGEX-KG原核表达载体,构建了重组质粒pKG-ns5,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的nsORF5基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-nsGP5分子量约为43kD,并具有反应活性,这为进一步研究PRRSV GP5蛋白的功能及新型疫苗、血清学诊断方法的研制奠定了基础.     

猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。     

猪呼吸道疾病综合征的主要病因浅析及防制措施

浅析猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的主要病因,分析其传染因素,讨论该病的综合防制措施,以利于养猪生产中预防该病的发生,降低猪场的经济损失.