通过染色体整合β-1,4-葡聚糖酶基因glu14提高绿色木霉对小麦纹枯病的防治效果

 绿色木霉LTR-2是生物防治菌株。利用来自巨大芽胞杆菌Ap25的β-1,4-葡聚糖酶基因glu14构建木霉表达载体pSilent/glu14,利用限制性内切酶介导法(REMI)转化绿色木霉LTR-2。PCR扩增及Southern杂交证实目的基因已插入木霉转化子的染色体DNA上。转化子的β-1,4-葡聚糖酶水解活性,对小麦纹枯病菌的平板抑制作用及温室防治效果较原始菌株LTR-2明显提高(P<0.01),其中转化子L-10的效果最好,平板抑制率比LTR-2提高了27.0%,温室防治效果比LTR-2提高了26.7%。本试验表明,利用REMI技术,将β-1,4-葡聚糖酶基因重组到木霉染色体DNA上,是获得高效木霉工程菌株的有效手段。     

巨大芽孢杆菌P1的解磷效果与发酵条件研究

以巨大芽孢杆菌P1为研究对象,利用钼锑抗比色法测定了菌株的解磷能力,采用单因子实验及正交实验优化了菌株的最佳发酵条件,并在10 L发酵罐上进行了发酵条件验证。巨大芽孢杆菌P1在蛋黄培养基上可产生明显的溶磷圈,溶磷圈直径和菌落直径的比值D/d=4.5。在卵磷脂液体培养基中培养4 d后,上清液中的有效磷含量为55.66 mg/mL,是对照的101.2倍,说明溶磷效果明显。单因子实验表明,最佳培养温度为32℃,培养时间为32 h,培养基初始pH为7.5。正交实验表明,最佳培养基组成为玉米粉20 g,黄豆粉10 g,K2HPO41.5 g,MgSO4.7H2O 1.5 g,CaCO31.5 g,H2O 1 000 mL,pH 7.5。方差分析表明,玉米粉、黄豆粉在α=0.05水平上对实验结果的影响存在显著性差异。10 L发酵罐发酵结果表明,巨大芽孢杆菌P1发酵32 h基本达到终点,菌数达到60.0×108cfu/mL,芽孢比率达90%以上。     

利用原生质体融合构建耐盐固氮菌

为提高多功能褐球固氮菌YKT41(Azotobacter chroococcum)的耐盐碱能力,将耐盐菌微球菌(Micrococcus sp.)MNY2与该固氮菌进行原生质体融合.采用选择性及非选择性培养基对融合子进行12次传代试验后,获得稳定融合子15株,生物测定表明,融合子YM2和YM9表现出双亲的固氮、耐盐、抑菌等优良性状.     

绿色木霉LTR-2菌株的紫外线诱变改良

通过紫外线诱变处理 ,获得了可以在低温下 (1 0℃ )生长的绿色木霉LTR 2的快速生长型突变株LR ,以及对多菌灵具有抗性的突变株LRR。突变株对棉枯萎病菌、棉黄萎病菌、棉立枯病菌的平板拮抗能力一般低于野生型菌株。LR比LTR 2更能适合非根际土壤环境 ,而LRR在健康棉花根际的定殖能力上 ,比LTR 2有明显下降。LR对棉花立枯病基本没有防治效果 ,但对棉花黄萎病和枯萎病的防治效果则高于原始菌株 ;LRR对棉花上述 3种病害的防治效果与原始菌株没有明显的差异     

玉米醇溶蛋白ze19基因启动子克隆与功能分析

从玉米自交系9801基因组DNA中克隆玉米醇溶蛋白基因ze19启动子,将其克隆到pMD18-T载体上.该序列与发表序列同源性为94％,包括TATA box、CAAT box启动子基本元件以及多种参与调节醇溶蛋白表达的顺式元件.将ze19启动子取代质粒PBI 121-gus中的CaMV35S启动子,构建由ze19启动子驱动GUS的植物表达载体pBIze19-gus,利用土壤杆菌介导法将重组载体pBIze19-gus转入烟草中.对转基因烟草植株GUS活性的定性与定量分析结果表明,ze19启动子驱动GUS基因在转基因烟草种子中表达活性最高,在叶片中活性很弱,在茎中没有活性.所克隆的ze19启动子具有种子特异表达特性,为玉米种子生物反应器的研究提供借鉴.     

TL2的鉴定及其对植物病原菌的抑制作用

对枯草芽孢杆菌TL2进行了16SrDNA序列分析,结合菌落形态、生理生化特征研究,将其鉴定为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。通过对峙培养法测定TL2对10种植物病原菌的抑制作用,结果表明,对峙培养5d后,TL2对10种病原菌均有不同程度的抑制作用,其中枯草芽孢杆菌TL2对辣椒疫霉菌的平均抑制率最高(65.12%),对苹果轮纹病菌的平均抑制率最低(24.14%)。     

利用玉米秸秆培养木霉菌分生孢子的研究

为了研究利用资源丰富的玉米秸秆作为发酵基质生产木霉分生孢子的可行性,本文研究了秸秆基质细度、含水量、外加营养成分及搅拌等因素对木霉分生孢子产孢量的影响。结果表明,细度适中,在40~10目之间,含水量60%~70%,利于木霉产孢,分生孢子产量可达1.27×1010 cfu/g(干培养物);接种量对最终产孢量影响不大,处理间差异不明显;通过添加碳源葡萄糖,并加入少量(NH4)2SO4、CaCO3、KH2PO4和MgSO4无机盐,可显著提高木霉分生孢子的产量,分生孢子产量最高可达2.0×1010 cfu/g(干培养物);但在固体培养过程中,对基质进行搅拌,不利于木霉分生孢子的形成。由此表明,利用玉米秸秆固体发酵生产木霉分生孢子可行、高效、无污染,对于木霉菌剂的生产和推广具有重要的参考价值。     

芽孢杆菌SH6-1的分离鉴定及其生物活性测定

菌株SH6-1分离自山东省寿光大棚黄瓜根际土中,经16S rDNA序列分析及常规生理生化测定,将其鉴定为巨大芽孢杆菌。菌株SH6-1具有较好的固氮、解磷、解钾能力,培养5d后发酵上清液的含氮量为3.573μg/mL,KCl含量为9.139μg/mL,培养2d后发酵上清液的P2O5含量为2932.5μg/mL。在温室条件下,菌株SH6-1对小麦株高及鲜重增加率分别为8.8%、33.8%,对番茄株高及鲜重增加率分别为12.2%、15.4%,对小麦纹枯病和番茄立枯病的防治效果分别达到了57.8%、61.7%。     

木霉双价基因表达载体的构建

利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。