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禽流感重组禽痘病毒疫苗不同途径及剂量接种的免疫效力 总被引:1,自引:0,他引:1
将表达禽流感病毒(AIV)H5 HA和N1 NA基因的重组禽痘病毒(rFPV—HA—NA)以不同剂量分别经翅下刺种、肌肉注射、皮下注射、点眼及滴鼻途径接种于4周龄SPF鸡。结果,该疫苗经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种的SPF鸡,能够诱导其产生血凝抑制(HI)抗体;用100LD50的HPAIVA/Goose/Guangalong/1/96(H5N1)毒株攻击后,免疫鸡无一发病和死亡,免疫保护率为100%。以点眼和滴鼻途径免疫的SPF鸡,大剂量接种能够诱导产生一定水平的抗体,攻毒后的保护率分别为83.3%、66.7%;而小剂量接种则不产生免疫反应,保护率为0。表明rFPV—HA—NA疫苗只有经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种,才能够诱导机体产生高水平的免疫力。 相似文献
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【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子,为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA,混合后反转录生成cDNA,利用长距离PCR(LD-PCR)扩增合成dscDNA,用CHROMA SPINTM+TE-400纯化柱纯化dsDNA,按照Clontech公司的Make Your Own"MatePlate"Library System操作程序,将带有同源臂的dscDNA与线性化p GADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,涂布SD/-Leu平板后于30℃培养4d左右,收集所有菌落,混匀分装即为Calu-3和A549细胞cDNA的酵母文库,并对文库库容、滴度及多样性进行分析。利用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切将A/Auhui/2/2005(H5N1)NP定向插入pGBKT7载体,构建高致病性流感病毒NP的诱饵质粒p GBKT7-NP,经验证该质粒无自激活活性,并进一步采用构建完成的Calu-3/A549细胞酵母文库进行杂交筛选,筛选得到的正确阅读的猎物质粒与诱饵质粒共转Y2H Gold酵母菌,分别以BD-P53/AD-T7作为阳性对照和BD-Lam/AD-T7作为阴性对照,挑取最终在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/Aro A(SD/-4/X/A)固体培养板上生长良好且变蓝的菌落,即为候选与目标蛋白互作阳性的蛋白,提取酵母质粒,进行测序分析、序列比对和Gene Ontology分析。【结果】提取两种细胞RNA 28S与18S条带清晰,5S条带暗淡,表明所提RNA质量较高,基本无降解;对提取的RNA反转录纯化获得dscDNA,dscDNA条带呈弥散状,片段大小分布于500—2 000bp之间,说明不同丰度及大小的RNA均成功反转录;构建的dscDNA文库库容为1.5×10~7,滴度为2.2×10~8cfu/m L,重组率为88%,PCR鉴定文库插入片段,条带大小不一、多样性好;利用诱饵质粒与文库进行双杂交筛选,回交验证后得到11个与NP蛋白互作的宿主因子。经Gene Ontology分析显示,11个宿主因子参与的生物过程包括:细胞凋亡、胚胎发育、可变剪接、转录调节及细胞增殖等;涉及的分子功能包括:GTP结合活性、金属离子结合活性、DNA结合活性及转录因子活性。【结论】成功构建同时含有Calu-3和A549两种人源肺细胞cDNA的酵母文库,文库覆盖cDNA更全面,为后期筛选与流感病毒其它蛋白互作的宿主蛋白奠定基础,筛选得到与NP蛋白存在相互作用的宿主因子为进一步深入研究NP功能提供了可靠的前期数据。 相似文献
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禽流感病毒N1和N2亚型神经氨酸酶RT-PCR鉴别方法的建立 总被引:7,自引:1,他引:7
针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的禽流感病毒(AIV)N1、N2亚型神经氨酸酶基因设计了2对引物,建立了一种RT—PCR鉴别方法,其目的片段大小分别为358bp、377bp。经对A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/Turkey/England/N28/73(H5N2)、A/African starling/983/79(H7N1)和A/Turkey/Wiscosin/1/66(H9N2)病毒株的鸡胚尿囊液样品进行扩增,扩增片段的大小与预期大小完全相符。经对国内不同地区分离的16株AIV N1亚型和21株AIV N2亚型用RT-PCR方法检测,阳性检出率分别为87.5%(14/16)和95.2%(20/21);对50份样品进行盲检,准确率为98%(49/50)。 相似文献
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禽痘病毒感染对禽流感重组禽痘病毒疫苗免疫效力的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
表达禽流感病毒 (AIV)HA和NA基因的重组禽痘病毒rFPV_HA_NA能够诱导鸡体产生 10 0 %抵抗高致病性禽流感病毒 (HPAIV)H5N1的攻击。而当鸡群已进行禽痘疫苗免疫或者感染了禽痘病毒的情况下 ,此重组疫苗的免疫效力如何 ?首先用禽痘病毒S_FPV_0 17人工感染SPF试验鸡 ,既而在感染后的不同间隔时间接种重组疫苗 ,免疫后检测鸡群的HI抗体水平 ,同时用 10 0LD50 的HPAIVH5N1进行攻击。结果重组疫苗免疫与禽痘病毒人工感染时间间隔在 4周 (或以上 )时 ,预先感染禽痘病毒对重组疫苗的免疫效力不构成影响 ,对禽流感的保护力为 10 0 % ,而间隔时间在 1、2、3周时 ,重组疫苗的免疫保护效力则受到不同程度的影响。 相似文献
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正2018年6月27日,中国农业科学院重大产出科研选题"重大动物疫病新型标记疫苗创制"启动会在哈尔滨兽医研究所顺利召开。应邀出席会议的有中国农业科学院科技局熊明民副局长、项目处干部解沛;中国农业科学院财务局张士安副局长、姜成钢副处长。项目参与单位中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兰州兽医研究所、上海兽医研究所的相关团队首席科学家及主要研究人员近20人参加了本次会议。项目主持人哈尔滨兽医研究所所长步志高研究员从重 相似文献
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HA基因密码子及表达载体优化的H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果比较 总被引:5,自引:1,他引:5
为评估HA基因密码子优化及不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响,pCIHA5、pCAGGHA5 、pCIoptiHA5和 pCAGGoptiHA5分别以100 和10 μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后分别用100 LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV) A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况,分别于攻毒后第3、5和7无采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化,对4种疫苗单次免疫的免疫保护效果进行比较评估。结果表明,100 μg剂量组中, pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 均可对免疫鸡形成100%完全保护(不发病、不致死和不排毒),pCIoptHA5(75%) 和pCIHA5(50%)仅可形成部分免疫保护;10 μg剂量免疫组中, pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 可对免疫鸡形成100%的保护(不发病和不致死),pCIoptiHA5可形成对免疫鸡的部分免疫保护(75%),而pCIHA5则基本不能形成免疫保护。结果表明,HA基因密码子的优化以及鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果同时证明,通过密码子和载体的优化,可使H5亚型禽流感DNA疫苗有效免疫保护剂量降低至10 μg,其推广应用已具备充分的经济可行性。pCAGGoptiHA5作为免疫效果良好、成本低廉的优化DNA疫苗,有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。 相似文献