小鼠miR367逆转录病毒载体的构建与检测

为了探明小鼠体细胞重编程过程中miR367的作用机制,试验构建小鼠miR367逆转录病毒载体。根据NCBI上小鼠miR367的相关序列,从小鼠基因组中扩增miR367并将其连接到pMD18-T载体,然后对重组质粒进行双酶切并回收目的片段。将目的片段与pMXs逆转录病毒载体连接,然后依次经过酶切、PCR筛选阳性克隆和测序,最终构建逆转录病毒载体miR367-pMXs;采用磷酸钙法将miR367-pMXs转染plat-E细胞,以包装逆转录病毒颗粒;用逆转录病毒颗粒侵染小鼠胚胎成纤维细胞,在侵染后的第5天,提取被侵染细胞的总RNA,逆转录后获得cDNA,并采用Q-PCR方法检测侵染细胞中的miR367表达量。结果表明,被逆转录病毒侵染后,小鼠胚胎成纤维细胞中miR367的相对表达量比侵染前约提高了170倍。上述结果表明,成功构建小鼠miR367的逆转录病毒载体,为开展体细胞重编程机制的相关研究提供依据。     

转KAP6.1-GFP-蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S 绵羊成纤维细胞株的筛选

 【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用Bgl Ⅱ和Hin d Ⅲ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES2-EGFP质粒连接后构建真核表达载体pIRES2-EGFP-4S;将此载体线性化后,采用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因阳性细胞。【结果】筛选得到转pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞。对阳性细胞经体外培养后的检测显示：（1）细胞形态（长梭形）、细胞生长曲线（呈S形）、群体倍增时间（随培养时间增加逐渐缩短）和细胞接种率（细胞贴壁率及存活率在24 h内逐渐升高,并达到最高值125%）等均具有正常绵羊成纤维细胞的生物学特征;（2）阳性细胞经冷冻复苏后具有与新鲜阳性细胞相似的生物学特征;（3）PCR检测结果显示,pIRES2-EGFP-4S在阳性细胞的基因组中整合。【结论】获得具有在绵羊皮肤特异表达,且便于检测的转蜘蛛拖丝蛋白4S的绵羊成纤维细胞株。     

美洲水貂MC1R基因CDS区克隆与序列分析

为探讨水貂毛色差异形成的分子机制,试验利用美洲水貂肌肉组织对其黑色素皮质激素受体-1(MC1R)基因CDS区进行PCR扩增,并利用DNAMAN、ProtParam、TMHMM等生物信息学软件分析其氨基酸组成、与其他物种的同源性、跨膜区段等。结果表明:克隆获得的MC1R序列长度为954 bp,编码317个氨基酸;美洲水貂MC1R基因序列与欧洲水貂的同源性为95.49%,美洲水貂MC1R基因编码的氨基酸序列与欧洲水貂同源性为92.43%;得到带负电氨基酸13个,带正电氨基酸22个,极性氨基酸67个,疏水性氨基酸157个,为亲水性蛋白质;共得到7个蛋白质的跨膜结构域。     

小鼠MSTN基因RNA干涉载体的构建及干涉效率的检测

为了筛选小鼠肌肉生长抑制素(MSTN)基因的干涉序列,根据GenBank中小鼠的MSTN基因序列,采用RT-PCR方法克隆获得MSTN基因序列,构建其真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;根据MSTN基因序列设计合成3种MSTN基因干涉序列(M1、M2、M3),并构建相应的RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3。将构建的真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN单独或分别与3种干涉载体共转染293GP细胞,检测干涉载体对MSTN基因的干涉效率。结果表明:试验成功克隆得到与GenBank中的序列同源性为99.91%的小鼠MSTN基因序列,并构建了真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;与转染pcDNA 3.1(+)-MSTN后的293GP细胞中MSTN基因的相对表达量(1.000)相比,转染pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3后MSTN基因相对表达量明显下降,pRNAT-M1的干涉效率最高。说明研究成功获得对MSTN基因表达具有明显干涉作用的干涉序列。     

绵羊Klf4编码区的克隆、序列分析与原核表达

参照GenBank上牛和猪的Klf4 cDNA序列设计特异引物,采用RT-PCR方法从怀孕60d的胎绵羊皮肤总RNA中扩增绵羊Klf4基因编码区序列,利用生物学软件对其进行序列分析;将该编码区连接到原核表达载体pET-30b(+)上并转化BL21大肠杆菌,在IPTG诱导下进行表达。经测序,绵羊Klf4基因编码区序列包括终止密码子在内的1 434bp,编码477个氨基酸,已在GenBank上登录(登录号GQ280389),与牛、猪、马、人、猕猴、黑猩猩、鼠等物种相比,绵羊Klf4基因CDS区的核苷酸序列相应序列同源性分别为98.26%、93.81%、93.24%、90.24%、90.13%、90.37%和87.25%,其氨基酸序列同源性分别为99.58%、97.94%、96.02%、94.14%、93.51%、92.08%和92.66%;生物软件分析显示,绵羊Klf 4含有细胞核定位模体和锌指结构域。利用克隆获得的绵羊Klf4 cDNA所构建的表达载体pET-30-Klf4,经IPTG诱导在BL21大肠杆菌中成功表达相对分子质量约为57 000的融合蛋白His-Klf4。     

逆转录病毒载体介导的蜘蛛拖丝蛋白转基因小鼠的制备

为了建立通过转基因动物获得蜘蛛拖丝蛋白的方法,试验利用前期构建的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)逆转录病毒载体侵染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),通过嵌合体法制备转基因小鼠,并用PCR技术进行鉴定。结果表明:成功获得嵌合体小鼠;目的基因2S-IRES-EGFP已整合入F0代及F1代嵌合体小鼠的鼠尾基因组中。说明利用逆转录病毒可成功获得表达蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)的转基因小鼠。     

miR-16逆转录病毒载体的构建与表达检测

为了探明miR16在体细胞重编程过程中的作用机制,构建小鼠miR-16逆转录病毒载体。根据NCBI上小鼠miR16的相关序列,从小鼠基因组中扩增miR-16核心序列并将其连接到p MD18-simple载体,对重组质粒进行双酶切回收目的片段。将目的片段与p MXs逆转录病毒载体连接,经过酶切、PCR和测序鉴定,最终构建逆转录病毒载体miR16-p MXs;采用脂质体法将miR16-p MXs转染plat-E细胞,以包装逆转录病毒颗粒;用逆转录病毒颗粒侵染小鼠胚胎成纤维细胞,在侵染后的第5天,提取被侵染细胞的总RNA,反转录后获得cDNA,并采用q PCR方法检测侵染前后细胞中miR-16的相对表达量。结果显示,被逆转录病毒侵染后,小鼠成纤维细胞中miR-16的相对表达量比侵染前约提高1 460倍。结论:成功构建具有表达活性的microRNA16逆转录病毒载体,为进一步开展miR-16在细胞重编程中的作用机制的相关研究提供了依据。     

重复交配对雌性金州黑色标准水貂繁殖性能的影响

为建立完善的金州黑色标准水貂交配体系,选择性成熟的雌性和雄性金州黑色标准水貂,采用同一雄性的2次交配("1+1"、"1+7"或"1+8")、同一雄性3次交配("1+7+1'或"1+8+1")、不同雄性2次交配("A1+B7"或"A1+B8")和不同雄性3次交配("A1+A7+B1'、"A1+B7+B1"或"A1+B7+...     

拟蜘蛛拖丝蛋白基因在小鼠颗粒细胞中的整合及其鉴定

为了探讨拟蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体(2S)在小鼠颗粒细胞基因组中整合和建立转拟蜘蛛拖丝蛋白基因的小鼠颗粒细胞系的可能性,试验将在前期工作中人工合成的拟蜘蛛拖丝蛋白基因2S连接到具有CMV启动子、IRES序列和GFP报告基因的表达载体,并转染小鼠颗粒细胞。结果表明:原代培养的幼鼠卵巢的颗粒细胞在培养后的第4天达到85%汇合,继代培养1~7代时每代达到85%的汇合时间约为3 d,细胞的形态与原代培养细胞相似,呈现多角形或梭形;筛选阳性细胞的最佳G418浓度为500μg/mL;将线性化的CMV-2S-pIRES2-EGFP转染颗粒细胞,再用500μg/mLG418筛选12 d后仍有存活细胞,但是续培养细胞的增殖能力逐渐丧失;经PCR鉴定,阳性细胞扩增出目的条带。     

小鼠去透明带裸卵的体外受精及其胚胎发育

为了建立提高小鼠弱精子体外受精率的新方法 ,将小鼠宰杀在 2 0℃下搁置 14 h,然后取出附睾尾精子进行冷冻保存。用解冻后活力明显下降的精子 ,与去透明带裸卵进行体外受精。结果显示 ,与带有颗粒细胞卵的体外受精率(0 % )和透明带切开卵的体外受精率 (4%～ 31% )相比 ,去透明带卵的体外受精率增至 39%～ 6 8% (P<0 .0 1) ;体外受精所获的 2细胞胚 ,经培养有 74 %～ 10 0 %的胚胎发育至扩张囊胚 ;来自 BDF1雄性小鼠精子的 2细胞期体外受精胚 ,经体外培养至囊胚期后再移植 ,获得了正常新生小鼠。以上结果表明 ,去透明带裸卵与小鼠弱精子体外受精 ,可提高小鼠弱精子的利用率