用亲和层析法提取大片吸虫谷胱甘肽转移酶的研究

为了探明大片吸虫谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）的多肽组分和酶活力,以供今后进行ＧＳＴ的免疫原性和各种蠕虫ＧＳＴ的交叉免疫原性的研究,本试验首次用亲和层析法对大片吸虫ＧＳＴ进行提取,用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析了大片吸虫ＧＳＴ的多肽组分,用１－氯－２,４－二硝基苯（ＣＤＮＢ）为底物测定了ＧＳＴ酶活力。电泳染色结果表明,大片吸虫ＧＳＴ至少有２条带,其分子量为２９．９～２４．５ＫＤ,其中主带２条,分别为２８．３、２６．２ＫＤ。酶活力测定结果表明,提取的ＧＳＴ可获得１０．４４μｍｏｌ／Ｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上的酶比活性。     

卡片PCR法检测果汁饮料中卡耶他环孢子虫技术的建立

为建立一种快速检测果汁饮料中卡耶他环孢子虫的方法,采用FTA卡片法提取果汁饮料中的卡耶他环孢子虫DNA,利用特异性引物组F1E／R2B、CC719／CRP999进行巢式PCR。以柔嫩艾美耳球虫、贝氏隐孢子虫等作为对照,结果显示,除卡耶他环孢子虫外,均无特异性条带。用卡耶他环孢子虫卵囊进行巢式PCR敏感性试验,结果显示敏感度最高达1．0×10^0个／mL。可见,FTA．PCR方特异、敏感,能用于新鲜食品中卡耶他环孢子虫的检测。     

柔嫩艾美耳球虫伴侣蛋白TCP-1亚基α的特性和功能初步分析

柔嫩艾美耳球虫是一种重要的寄生于鸡盲肠细胞内的寄生原虫,可引起危害严重的鸡球虫病。目前,对鸡球虫病的预防和治疗主要依靠抗球虫药,而药物的广泛使用使球虫产生了严重的耐药性。为研究球虫耐药性产生的机制,本实验室前期对诱导的地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株和亲本敏感株进行转录组测序,经分析发现TCP-1亚基α为耐药株和敏感株的差异表达基因且在耐药株上调表达。本文以柔嫩艾美耳球虫敏感株为模板,成功克隆出TCP-1亚基α基因,构建了原核表达重组质粒p ET-Et TCP-1α,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TCP-1α,用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔和BALB/C小鼠获得多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法检测柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株TCP-1亚基α基因的m RNA转录和翻译水平,同时检测了该基因在球虫不同发育阶段的转录水平和翻译水平。结果显示,Et TCP-1α在2个耐药株的m RNA转录和蛋白翻译水平明显高于敏感株,而且该蛋白在第二代裂殖子的表达最高;间接免疫荧光实验显示该蛋白主要位于子孢子和第二代裂殖子表面,当虫体入侵DF-1细胞进行裂殖生殖后,该蛋白分布于整个虫体,且表达量明显升高。因此,推测Et TCP-1α在柔嫩艾美耳球虫细胞内的生长发育和耐药性的产生过程中发挥了一定的作用。     

上海市市售蟾蜍寄生蠕虫感染情况初步调查

为了解上海市市售蟾蜍寄生蠕虫的感染情况,对60只中华大蟾蜍进行剖检,按脏器检查、收集寄生虫虫体,统计寄生虫的感染率与感染强度。结果显示,蟾蜍寄生虫感染率为100%,平均感染强度为28.23条。不同种类寄生虫的感染情况明显不同,线虫、吸虫、绦虫和棘头虫的感染率分别为93.33%、73.33%、8.33%和15.00%,感染强度分别为17.52、14.48、10.40和2.67条。不同脏器寄生虫的感染情况不同,肠道和肺脏的寄生虫感染率最高,分别为100%和88.33%;肠道、肺脏、肌肉寄生虫的感染强度分别为15.63、12.28和11.33条,明显高于其他器官。不同种类寄生虫的寄生虫部位明显不同,线虫主要来源于肺部和肠道,吸虫和棘头虫主要来源于肠道,绦虫主要来源于肌肉。通过对检出虫体的形态进行初步观察,吸虫、线虫、绦虫和棘头虫种类分别约有3、4、1和1种,但具体种类尚需进一步鉴定。本调查结果为掌握上海市市售蟾蜍寄生虫感染状况和做好寄生虫病防控提供了基础数据。     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列(克隆号为M20),采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

上海市市售青蛙寄生蠕虫感染情况初步调查

为了解上海市市售青蛙蠕虫的感染情况,对52只黑斑蛙(Rana nigromaculata)进行剖检,按脏器检查、收集寄生虫虫体,统计寄生虫的感染率与感染强度。结果显示,青蛙蠕虫感染率为90.38%,平均感染强度为20.21条。不同种类寄生虫的感染情况明显不同,线虫、吸虫、绦虫和棘头虫的感染率分别为50.00%、86.54%、17.31%和51.92%,感染强度分别为3.38、15.00、5.11和5.22条。不同脏器寄生虫的感染情况不同,肠道的寄生虫感染率最高,为90.38%;肠道、肌肉与皮下寄生虫的感染强度分别为15.34和11.38条,明显高于其他器官。不同种类寄生虫的寄生虫部位明显不同,线虫、吸虫和棘头虫主要来源于肠道,绦虫主要来源于肌肉与皮下。通过对检出虫体的形态进行初步观察,吸虫、线虫、绦虫和棘头虫种类分别约有6、3、1和2种,但具体种类尚需进一步鉴定。本调查结果为掌握上海市市售青蛙寄生虫感染状况和做好寄生虫病防控提供了基础数据。     

安徽两个鸡场球虫的抗药性试验

[目的]研究安徽2个鸡场球虫抗药性程度,为制定出合理的用药方案提供依据。[方法]从鸡场采集新鲜粪便,经实验室分离增殖,并人工感染孢子化卵囊,测定对地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜拉霉素、盐霉素和拉沙洛西钠8种药物的抗药性。[结果]安徽1号鸡场球虫对癸氧喹酯无抗药性,尼卡巴嗪中度抗药,其余6种药物完全抗药;安徽2号鸡场,对癸氧喹酯河尼卡巴嗪无抗药性,氯苯胍中度抗药,其余5种药物完全抗药。[结论]安徽两鸡场球虫对多数药物已产生抗药性。     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列（克隆号为M20）,采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

上海市部分鸟类寄生蠕虫感染情况调查

为了解上海市鸟类寄生虫感染现状,于2012年从上海市部分花鸟市场分批购买了11科21种103只鸟,采用完全剖检法对鸟类消化道及各脏器进行寄生虫检查。结果显示,有14种33只鸟检出蠕虫,鸟种类的蠕虫感染率为66．67％（14／21）,鸟个体的蠕虫感染率为32．04％（33／103）,其中黄鹂、灰背鸫、灰喜鹊、丝光椋鸟、喜鹊、野鹌鹑等6种鸟的检出率较高,感染率为60％～100％。在检出蠕虫的14种33只鸟中,共检获蠕虫932条,其中从9种16只鸟检获吸虫268条,从8种17只鸟检获绦虫631条,从7种12只鸟检获线虫17条,从4种7只鸟检获棘头虫16条。在检获的932条蠕虫,分别来自肺脏、肾脏、肝脏（胆囊）、肠道,而在心脏、气管、胃、皮下等组织器官未检出蠕虫。肠道是寄生虫寄生的主要场所,从27只鸟的肠道检获746条蠕虫,分别占阳性鸟和蠕虫数的81．82％（27／33）、80．04％（746／932）;其次为肝脏（胆囊）,从8只鸟的肝脏（胆囊）检获182条蠕虫．分别占阳性鸟和蠕虫数的24．24％、19．53％。在感染强度上,野鸽子和鸟灰鸫的蠕虫感染强度最高,平均每只分别检出171条和123条,其次为灰背鸫（53条／只）。调查结果表明,上海市鸟类寄生虫的种类多,且蠕虫的各大类（吸虫、绦虫、线虫、棘头虫）均有检出,依据检获的虫体数量,绦虫和吸虫是鸟类的主要寄生虫,调查结果为初步掌握上海市鸟类寄生虫的感染现状、做好鸟类寄生虫病的防控提供了基础数据。     

刚地弓形虫18S rDNA基因的克隆与序列分析

采用PCR方法从弓形虫RH株和CN株总DNA中分别扩增到18S rDNA基因，与pGEM-T easy vector连接，并进行DNA测序分析。结果表明，2个虫株均扩增出1745bp的片段，用DNAMAN软件对其与GenBank上2个虫株相应序列进行同源性比较，4个虫株的同源性为99．34％。刚地弓形虫虫株在不同宿主和不同区域上存在着一定的差异。