宿主GAPDH对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响

目前,关于宿主细胞应对球虫感染机制的研究极其有限。在前期研究中,我们利用相对和绝对定量同位素标记技术结合液相色谱串联质谱技术分析了感染柔嫩艾美耳球虫子孢子72 h后鸡胚成纤维(CEF)细胞的蛋白质组表达变化,作者拟进一步研究其中一个上调蛋白——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。克隆鸡GAPDH基因并构建原核重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,表达重组GAPDH蛋白,用Western blot对表达进行验证。使用q-PCR、Western blot和免疫组织化学的方法检测感染柔嫩艾美耳球虫子孢子后DF-1细胞中GAPDH的表达量,并使用抗体抑制试验检测GAPDH多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。结果显示:成功克隆1 123 bp的GAPDH基因,并获得61.7 ku的重组GAPDH蛋白。q-PCR和免疫组织化学检测均显示,GAPDH在柔嫩艾美耳球虫子孢子感染的DF-1细胞中的表达显著升高。抗体抑制试验表明,与相同浓度的正常兔IgG相比,50、100、200、300和400μg·mL~(-1)的抗GAPDH抗体均能明显抑制子孢子的入侵。以上结果表明,子孢子感染会引起宿主细胞GAPDH蛋白的上调,并且宿主GAPDH蛋白在子孢子入侵过程中起正调控作用。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子高表达新基因的克隆、表达及分析

为克隆和研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)新基因,本研究在所获得的ESTs序列的基础上,应用RACE技术克隆获得了1个在子孢子阶段高表达新基因的全长cDNA序列(GU553107),命名为ZB7-C11,该基因全长1439bp,ORF为525bp,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量约为18.7ku。Real-timePCR对E.tenella不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析显示,该基因在子孢子阶段的表达高于其它阶段。另外,将ZB7-C11克隆于pGEX-4T中构建重组质粒pGEX-4T-C11,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达6h后其表达量最高,并且重组蛋白分子量约44.7ku大部分以可溶性存在。Westernblot分析显示该重组蛋白可被抗E.tenella的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

用亲和层析法提取大片吸虫谷胱甘肽转移酶

为了探明大片吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)的多肽组分和酶活力以供今后进行 GST 的免疫原性和各种蠕虫 GST 的交叉免疫原性的研究,本试验首次用亲和层析法对大片吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)进行提取,用 SDS-PAGE 分析了大片吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)的多肽组分,用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)为底物测定了 GST 酶活力.电泳染色结果表明,大片吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)至少有2条带,其分子量为29.9～24.5kD,其中主带2条,分别为28.3和26.2kD。酶活力测定结果表明,提取的 GST 可获得10.44μmol·min~(-1)·mg~(-1)以上的酶比活性.     

黑龙江大山种羊场羊线虫抗药性的检测──粪便虫卵减少试验检查线虫抗药株

为了查明羊线虫对某种药物的抗药性,本试验用粪便虫卵减少试验（ＦＥＣＴＲＴ）对黑龙江大山种羊场羊线虫的抗药性进行了检测。结果表明该羊场的羊线虫对丙硫苯咪唑产生了抗药性;改用佳灵三特、羊佳２号进行治疗,获得较为满意的结果。粪卵减少试验是检测线虫抗药性的一种简单实用的方法。     

野生动物园动物寄生虫调查

对某野生动物园的近25种以上的动物进行了寄生虫调查,调查采用随机抽样的方法检查了近700头份样品,发现了16种左右重要寄生虫,其中危害严重的有片形吸虫、血矛属线虫、狮弓首蛔虫、鞭虫、长角血蜱等。     

一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白单抗的制备及初步应用

利用原核表达的柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白（EtRP）的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，经4次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，经间接ELISA和Western blot筛选获得一株抗EtRP蛋白的特异性单克隆抗体细胞株，命名为2E3，亚类鉴定为IgG2a。细胞上清和小鼠腹水的效价分别为1：40和1：2．56×10^4。利用该单抗对EtRP在柔嫩艾关耳球虫子孢子中的分布进行分子定位，结果显示该蛋白主要分布于子孢子的顶端；而当子孢子在DMEM培养基中41℃孵育1h后，该蛋白则分布于整个虫体。研究结果表明，成功制备了EtRP单克隆抗体，为进一步研究球虫相关蛋白功能奠定了基础。     

不同保种时间及复苏代次弓形虫对小鼠致病性研究

为了评价液氮冻存不同时间后及在小鼠体内复苏不同代次的弓形虫速殖子感染小鼠致病性的研究,通过比较感染处理后的弓形虫小鼠健康及存活状况,筛选出更佳的液氮冻存时间和合适复苏代次,对于建立小鼠急性弓形虫感染模型及弓形虫致病机理等具有重要意义.通过腹腔注射不同保种时间(2、4、6月)和不同复苏代次(1、2、3代)弓形虫速殖子,观...     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列(克隆号为M20),采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因.用EcoRI和NotI酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用SacI将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达.RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段,是一个子孢子高表达基因.重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达.Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性.     

复方球立清等四种药物治疗鸡柔嫩艾美耳球虫的笼饲试验(二)

鸡球虫病是危害养鸡业主要疾病之一,尽管经过几代人的努力,但是鸡球虫病依然时常发生。目前鸡球虫病主要依靠药物预防为主。然而,由于耐药性、制剂技术、原料质量及其它一些不合理用药因素,往往造成抗球虫药物药效