马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码基质蛋白（p15)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达，所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白，其氨基端带有6个组氨酸的标签，因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化，在间接ELISA和免疫印迹试验中，重组的基质蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应，而与健康马血清无任何反应，这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性，可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体人免疫应答的研究中。     

Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。     

牛传染性鼻气管炎间接ELISA诊断方法的建立

以牛肾细胞系（MDBK）培养牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）Bartha Nu/67株,经超速离心纯化病毒,再经超声破碎处理后作为诊断抗原,建立了检测牛血清IBRV抗体的间接酶联免疫吸附试验.该ELISA的判定标准为：血清D490 nm值大于0.369的判为阳性,小于0.295的判为阴性,在0.295与0.369之间的为可疑.特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性高、重复性好.与法国进口ELISA抗体诊断试剂盒比较,其符合率为96.3%;与中和试验比较,符合率为95.8%,且敏感性更高.应用该诊断方法调查了我国部分地区IBRV的感染情况,结果显示,这些地区的IBRV感染率为67.1%.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的表达与多克隆抗体制备

为了制备BVDV的E0蛋白兔源多克隆抗体,试验采用大肠杆菌对E0蛋白进行了表达,根据已发表的BVDV的VEDEVAC株的全基因组序列设计1对扩增E0的引物,经RT-PCR扩增出长约680 bp的E0基因片段,然后将目的基因克隆到pET-30a载体上,经酶切鉴定获得阳性重组质粒后进行测序,再将测序正确的阳性重组质粒转化BL21表达菌,经扩大培养及IPTG诱导后获得以包涵体形式存在的重组E0蛋白,经亲和层析法纯化后进行Western-blot检测,同时以纯化的E0蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并对E0多克隆抗体进行了中和试验和免疫荧光检测。结果表明:E0蛋白具有良好的反应性;E0多克隆抗体的病毒中和试验测定其中和抗体效价达到1∶128,具有良好的反应性和特异性。说明制备的重组E0蛋白多克隆抗体可以用于BVDV的检测。     

3株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其基因分型

为确定牛呼吸道传染病的病原以及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在临床健康牛群中是否存在持续性感染,本研究采集了内蒙古自治区和黑龙江省两个牛场牛鼻拭子46份及肺脏样品8份,采用MDBK细胞进行病毒分离培养,经BVDV特异性引物RT-PCR检测有3份样品为阳性。利用间接免疫荧光检测3株阳性样品,可以观察到特异性荧光,表明分离得到3株BVDV,分别命名为480、A0583和Lung-6。进一步研究显示480、A0583和Lung-6均为非致细胞病变型。对3株分离病毒的5'端非编码区和Npro基因进化树分析显示3株病毒均属于BVDV1型,其中480株属于BVDV1c亚型,A0583株和Lung-6株同属于BVDV1m亚型。本研究首次在国内同一个牛场分离到BVDV1m(A0583)和BVDV1c(480)两个基因亚型。本研究为我国BVDV-1型不同基因亚型的抗原关系分析及BVDV疫苗的研制奠定了基础。     

中国马传染性贫血病毒驴强毒株感染性分子克隆的构建

 马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）驴强毒株DV是一株经过驴体传代获得的而具有超强毒力的毒株，对马和驴均可100％致死。用PCR方法分段扩增了DV其前病毒基因，将包含全基因片段的3个基因克隆以限制性内切酶消化后顺次连接克隆到pLG338上，命名为pD70344。将此克隆体外转染驴胎皮肤细胞和驴白细胞，连续盲传3代并以反转录酶活性测定，RT-PCR鉴定其病毒活性，透射电镜观察发现细胞培养物中存在大量典型病毒粒子，证明获得了1株具有感染性的EIAV病毒粒子，命名为pD70344V。经序列测定确认了本试验首次构建了1株完全来源于EIAV强毒基因的感染性分子克隆，将此克隆病毒接种驴，可以引起典型的马传贫症状并导致试验动物死亡。该分子克隆的建立为进一步考察病毒的毒力与基因的关系提供了良好的平台。     

我国主要猪病毒性腹泻疾病的现状和对策

在引起猪腹泻病的各种病因中,病毒性腹泻的危害是最为严重的,它可以引起仔猪的死亡,成猪的掉膘,饲料报酬的降低,增加人工费和药费的开支等危害,是危害养猪业的重要传染病。     

我国主要猪病毒性腹泻疾病的现状和对策

在引起猪腹泻病的各种病因中 ,病毒性腹泻的危害是最为严重的 ,它可以引起仔猪的死亡 ,成猪的掉膘 ,饲料报酬的降低 ,增加人工费和药费的开支等危害 ,是危害养猪业的重要传染病。1　引起病毒性腹泻的主要病毒猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒是我国流行性病毒性腹泻的主要病原 ,同时其他病毒如肠病毒感染、猪腺病毒感染、星状病毒、杯状病毒、诺瓦克病毒、细小病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒也可以引起猪只的腹泻 ,可以说 ,病毒性腹泻的病因是十分复杂的 ,应引起足够的重视。2　我国流行的主要病毒性腹泻病及其特点2 1　猪传染性胃肠…     

恶臭假单胞杆菌转谷氨酰胺酶基因的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR方法扩增恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)H76的转谷氨酰胺酶(transglutaminase,TGase)基因,然后将扩增的约800bp的基因片段克隆到pET-28a( )表达载体上,构建重组TGase的表达载体.酶切鉴定阳性的重组质粒命名为pET-TGase.核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与恶臭假单胞杆菌KT2440的相应基因有很高的同源性.该载体的构建为进一步研究转谷氨酰胺酶的生物学功能以及应用提供了基础.