干扰Smad3促进山羊脂肪细胞分化

旨在克隆山羊Smad3的基础上，明确其组织和细胞表达谱，最终阐明干扰Smad3基因对山羊肌内和皮下脂肪细胞分化的影响。本研究选用5只体况良好的1周龄简州大耳羊，空腹24 h后屠宰并采集相应组织和细胞进行试验。利用RT-PCR技术克隆山羊Smad3基因cDNA区序列并进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技术检测Smad3基因的组织和细胞时序表达水平；并且合成靶向Smad3的siRNA，采用油红O染色从形态学上明确干扰Smad3对山羊前体脂肪细胞成脂分化的影响，利用qPCR检测干扰Smad3对脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、PPARγ、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15以及Smads相关基因Smad2、Smad4、Smad7和TGF-β1基因mRNA表达水平的影响，探讨可能的作用机制。结果，获得山羊Smad3基因1 449 bp，其中CDS区序列为1 278 bp，编码425个氨基酸；Smad3在山羊各组织中具有广泛表达特性，且在肾脏中的表达水平最高（P<0.01）；Smad3均在山羊肌内和皮下两种脂肪细胞诱导分化的36 h表达量最低，极显著低于在未分化前体脂肪细胞中的表达丰度（P<0.01）；干扰Smad3后发现显著促进了山羊肌内和皮下脂肪细胞中脂滴的聚集，且脂肪细胞分化标志基因、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15的表达水平显著上升（P<0.05），Pref-1的相对表达水平极显著下降（P<0.01），同时干扰Smad3基因下调了Smad2、Smad4和Smad7基因的相对表达水平（P<0.05）。研究结果指出，干扰Smad3促进山羊脂肪细胞分化，且可能通过调控脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15等及协同Smad2、Smad4和Smad7的表达来实现的。     

藏鸡GEM基因克隆及其时空表达特性分析

旨在获得藏鸡GEM基因序列,阐明其组织表达和时序表达谱,同时分析基因表达与肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)沉积的关系,为进一步研究藏鸡肉质和脂肪沉积奠定基础。选取1,81,119,154,210日龄健康藏鸡为试验材料,屠宰后分别采集心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌和皮下脂肪组织,提取组织总RNA,利用RT-PCR技术克隆藏鸡GEM基因序列,利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在藏鸡不同组织以及不同发育时期胸肌和腿肌的表达情况。结果表明,克隆获得藏鸡GEM基因序列940 bp(Gen Bank登录号:KY747399),其中,CDS为894 bp,5'UTR 24 bp和3'UTR22 bp,编码297个氨基酸,与原鸡、绿头鸭、人和小鼠GEM氨基酸序列相似性较高(83.50%~98.32%);组织表达结果显示,GEM在藏鸡肺组织中的表达水平最高,极显著高于其他组织(P0.01),在脂肪组织和脾组织中也存在较高水平的表达;时序表达结果显示,GEM基因在不同发育阶段藏鸡胸肌和腿肌中的表达模式存在差异,在胸肌中的表达水平随日龄的增加呈下降趋势,而在腿肌中随日龄的增加呈先上升后下降的表达趋势,且在119日龄达到峰值;GEM基因表达水平与不同发育阶段藏鸡胸肌和腿肌中IMF含量呈不同程度的相关,存在性别差异,且在公藏鸡腿肌中达到显著水平(r=0.414,P0.05)。结果表明,GEM基因可能在藏鸡脂质代谢中起重要调控作用。     

FGF10基因调节山羊成肌细胞分化相关基因表达的研究

为了阐明FGF10基因对山羊成肌细胞分化的影响,试验以简州大耳山羊羔羊的成肌细胞为研究对象,体外培养并诱导分化为肌管,采用实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因在诱导分化过程中的表达水平;同时采用腺病毒过表达和SiRNA干扰技术、形态学观察和实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因功能获得和缺失对成肌细胞中肌管形成的...     

牦牛Linc24063的克隆鉴定及其与miRNAs 表达水平的相关性分析

【目的】通过对牦牛长链非编码RNA Linc24063进行克隆鉴定,分析其在乳腺组织中与miRNAs表达量的相关性,为Linc24063通过调控miRNA发挥功能的调控机制研究提供试验依据。【方法】选取4.5岁处于第一泌乳期的健康母牦牛12头,清晨空腹屠宰后,迅速采集大脑、乳腺、肾脏、心脏、肝脏和卵巢组织,提取组织总RNA,利用5′ RACE和3′ RACE方法克隆牦牛Linc24063序列;利用生物信息学对其序列保守性、染色体定位及编码潜能进行分析,然后利用原核表达试验对其编码能力进行验证;利用RT-qPCR检测其在大脑、乳腺、肾脏、心脏、肝脏和卵巢的表达水平。利用普通牛和绵羊的miRNA数据库,结合miRanda和mireap软件预测与Linc24063具有相互作用的物种间保守miRNAs,与前人研究表明在牛不同泌乳时期乳腺组织中具有差异表达的miRNA取交集,然后对其靶基因进行GO富集和KEGG信号通路分析;最后使用皮尔逊相关系数在乳腺组织中进行Linc24063与miRNAs表达量的相关性分析。【结果】Linc24063 5′RACE和3′RACE片段大小分别为476 bp和356 bp,测序分析表明Linc24063大小为758 bp,位于牦牛21号染色体的Dlk1-Dio3印记域,与普通牛的序列保守性最高。生物信息学预测其编码潜能较低,原核表达试验进一步验证Linc24063不能有效的翻译蛋白,表明Linc24063是一个真正的长链非编码lncRNA。组织表达谱分析表明,Linc24063在牦牛乳腺组织中表达量最高,在肝脏和卵巢中表达量较低。生物信息学分析后共筛选到与Linc24063具有相互作用的物种间保守miRNAs 21个,其中有研究报道在乳腺中有差异表达的13个;13个miRNAs靶基因富集到TGF-β、PI3K-Akt、胰岛素等信号通路中,表明Linc24063可能通过这些信号通路参与牦牛乳脂和乳蛋白的生物合成过程。在乳腺组织中,Linc24063表达水平与miR-200a（P=0.001）、miR-141（P=0.02）显著负相关,与miR-27a（P=0.023）显著正相关,与miR-24（P=0.601）不具备相关性。【结论】Linc24063位于Dlk1-Dio3印记域内,在乳腺组织中具有较高表达量,且可能通过与miR-200a、miR-141和miR-27a相互作用从而参与牦牛乳脂和乳蛋白的生物合成过程。为深入探讨牦牛Linc24063在乳脂和乳蛋白合成中的生物学功能提供了基础数据。     

山羊DGAT1基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGAT1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳公羊（n=7）为试验动物。采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测DGAT1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊DGAT1基因序列全长1 651 bp （GenBank登录号：MT221183）,包含5'UTR 125 bp,CDS 1 470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGAT1在细胞中过表达极显著（P<0.01）,GPAM基因的相对表达水平显著上调（P<0.05）,ADRP和ACOX1基因极显著上调（P<0.01）,而AGPAT6基因相对表达水平显著下调（P<0.05）,MLYCD和HSL基因极显著下调（P<0.01）;油红O染色结果显示,过表达DGAT1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多（P<0.01）,甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量（P<0.01）。本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据。     

添加不同比例啤酒糟对育肥山羊生长性能、血清生化指标、屠宰性能和肉品质的影响

本研究旨在探究山羊日粮中添加不同比例啤酒糟对育肥山羊生长性能、血清生化指标、屠宰性能和肉品质的影响。随机选取24只身体状况良好、体质量相近的3月龄简州大耳羊羯羊,分为4组,分别饲喂添加0、42.90%、48.00%、53.00%啤酒糟的日粮。试验周期为70 d,其中预饲期14 d,正式期为56 d。结果表明,与对照相比,在日粮中添加48.00%啤酒糟处理的山羊只均经济利润显著提高,并且该处理对血清生化指标、屠宰性能和内脏指标无不利影响,还在一定水平上改善了山羊肉品质。综上所述,本研究条件下,在简州大耳羊羯羊日粮中添加啤酒糟的最适比例为48.00%。     

干扰山羊KLF12促进皮下脂肪细胞分化

[背景]脂肪组织分为皮肤下的皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue,SAT)和腹部内器官周围的内脏脂肪组织(visceral adipose tissue,VAT),皮下脂肪作为影响肉类美味与否的重要因素,探究皮下脂肪沉积分子调控机制对于育种改良和畜牧业的发展至关重要.Krüppel-li...     

干扰SERBP1表达对山羊鼻甲骨原代细胞增殖、周期及凋亡的作用

旨在克隆山羊SERBP1基因,揭示干扰SERBP1基因后对山羊鼻甲骨原代细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的作用,为进一步研究羊口疮病毒诱导细胞凋亡的分子机制奠定基础。本研究以简州大耳羊为试验动物,利用RT-PCR技术克隆SERBP1基因cDNA序列并进行生物信息学分析;实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测SERBP1基因在不同组织的表达水平;并筛选有效干扰序列;MTT法检测siRNA干扰SERBP1对山羊鼻甲骨原代细胞增殖的影响,流式细胞仪检测siRNA干扰SERBP1对细胞周期和凋亡的影响,RT-qPCR检测对凋亡相关基因P53、Caspase7、Caspase3等的影响。成功扩增山羊SERBP1基因1 293 bp,包含5'UTR 44 bp,CDS区1 179 bp,3'UTR 70 bp,编码392个氨基酸残基,不存在信号肽,主要定位于细胞核;预测到SERBP1可能与RPL31、RPS3等10个蛋白存在相互作用。SERBP1基因在山羊胰腺中表达水平最高;筛选到干扰效率为70%的有效干扰序列;siRNA干扰SERBP1基因后抑制了山羊鼻甲骨原代细胞增殖和凋亡,且细胞被阻滞于G₀/G₁期;同时可下调Caspase3、Caspase7、BCL2L11和Bax基因mRNA的表达,而对Bcl-2、P53、PARP1基因mRNA的表达无显著影响。干扰山羊SERBP1基因抑制了山羊鼻甲骨原代细胞增殖和凋亡,并诱导细胞周期停滞。研究结果为进一步深入研究SERBP1基因功能,揭示ORFV125抑制细胞凋亡的分子机制提供重要的试验数据。     

KLF11抑制山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在获得山羊Krüppel样因子11(Krüppel-like factor 11,KLF11)基因序列,明确其组织及细胞表达模式,阐明KLF11对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响及可能作用途径。本研究利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测KLF11在山羊各组织及成脂诱导分化不同阶段细胞中的表达水平,利用油红O染色和qPCR等方法从形态学及分子生物学等角度确定干扰KLF11后对山羊肌内脂肪细胞分化的影响及可能的作用途径。结果表明,KLF11核苷酸序列总长为1 752 bp,CDS区为1 518 bp,编码505个氨基酸残基。KLF11基因在山羊各个组织中都有广泛表达,并且在肝、背最长肌及腹部脂肪中存在较高水平表达;KLF11在成脂诱导48 h的山羊肌内脂肪细胞中表达水平极显著高于诱导分化前(P<0.01)。筛选到干扰效率可达到63.58%的KLF11-siRNA1有效干扰序列,转染山羊肌内前体脂肪细胞后发现可明显促进山羊肌内脂细胞的脂滴积聚,且脂肪细胞分化标志基因PPARγ和C/EBPβ mRNA水平出现极显著上调(P<0.01),Pref-1 mRNA水平出现极显著下调(P<0.01);干扰KLF11基因后,KLFs有些成员(KLF1、KLF2、KLF4、KLF5、KLF8、KLF10、KLF14、KLF16)表达水平发生极显著下降(P<0.01),有些(KLF15)则出现相反的表达模式。KLF11基因可能通过调控PPARγ、C/EBPβ和Pref-1的表达抑制山羊肌内前体脂肪细胞分化,并且这种作用可能是通过协同KLF2、KLF4、KLF10,拮抗KLF7和KLF15来进行的。     

日粮中不同能量和蛋白水平对西农萨能羊泌乳量、乳成分及血浆生化指标的影响

为了筛选出产奶羊合适的日粮能量和蛋白水平,研究采用2×2二因子完全随机区组试验将60只处于泌乳盛期的西农萨能羊[体重为(60.00±7.88)kg]随机分为4组,分别饲喂能量水平为12.36 MJ/kg(干物质)和12.92 MJ/kg(干物质)、蛋白水平为13.25%和15.80%的日粮,研究不同能量和蛋白水平对泌乳量、乳成分及血液生化指标的影响。结果表明:各处理间产奶量无显著差异(P0.05);各组羊产奶量由产奶高峰期开始出现下降趋势,当能量水平为12.92 MJ/kg、蛋白水平为13.25%时泌乳量下降幅度最小,有利于保持产奶量。不同能量和蛋白水平对乳成分中的非脂固形物、乳糖、密度、冰点及酸度均无显著影响(P0.05),但是能量水平为12.92 MJ/kg、蛋白水平为13.25%时乳中乳脂、乳蛋白及全脂固形物的含量均低于其他处理,尤其是乳脂的含量显著降低(P0.05);能量水平为12.92 MJ/kg的2个试验组羊血浆中葡萄糖、三酰甘油及胆固醇含量均高于能量水平为12.36 MJ/kg的2个试验组(P0.05),各蛋白水平之间无显著差异(P0.05)。