番鸭呼肠孤病毒弱毒株在免疫番鸭体内的分布及排毒规律

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)B37弱毒株经肌内免疫1日龄雏鸭,应用RT-PCR检测病毒核酸,以阐明病毒在体内分布及排毒规律。结果表明,B37株免疫雏鸭后4h,即可在血液、心、肝、脾组织中检出DRV RNA;接种后8h,血液、心、肝、脾、肺、肾、胰腺均可检测到DRV RNA;接种后3d,喉头和泄殖腔棉拭子可检出DRV RNA;接种后14d,喉头和泄殖腔棉拭子已不能检出DRV RNA;接种后28d,肺、肾和胰腺均已不能检出DRV RNA;接种后42d,血和心脏已不能检出DRV RNA;接种后49d,所有组织均已不能检出DRV RNA。因此,DRV弱毒在血液、心脏中分布时间为接种后4h～35d,在肝、脾组织中分布时间为4h～42d;肺、肾和胰腺的分布时间为8h～25d;向外界排毒时间为3～14d。     

鸭2型腺病毒感染导致番鸭“肝白化病”的研究

2015年以来,福建省番鸭饲养区的雏番鸭群流行一种以肝脏肿大、颜色变淡呈黄白色、表面有斑驳状或散在点状出血点为特征的疫病,俗称番鸭"白肝病""肝白化病"。经流行病学调查、病原排查和分离病毒人工感染试验,初步表明该病病原为鸭2型腺病毒。     

新型鸭呼肠孤病毒病浓缩灭活疫苗的制备及免疫原性分析

为研制高效的新型鸭呼肠孤病毒病(NDRV)灭活疫苗,分别采用病毒尿囊液和浓缩后病毒尿囊液为抗原,经甲醛灭活处理后与常规油佐剂制成灭活疫苗,并进行种鸭免疫后血清学检测、雏鸭免疫保护及安全试验。结果表明,浓缩疫苗安全性好,能明显提高疫苗的免疫效果,高峰期抗体效价的免疫持续期比常规疫苗长;浓缩疫苗免疫雏鸭后的免疫保护性达100%。以上研究表明,NDRV浓缩疫苗安全、高效,在雏鸭上具有良好的免疫保护效果,具有良好的市场前景。     

应用胶乳凝集技术诊断番鸭小鹅瘟病

为建立番鸭源小鹅瘟病毒(GPV)快速检测方法,本研究采用GPV单克隆抗体(MAb)标记聚苯乙烯胶乳,建立了检测GPV抗原的胶乳凝集试验(LPA)。结果显示:LPA具有较好的敏感性,可以检出GPV最低毒价为1 000 TCI50/10μL;特异性强,仅与GPV产生特异性凝集反应,与其他相关鸭源病毒均无交叉反应;重复性和稳定性好,在4℃保存期达11个月;对人工感染病例的LPA检测结果与PCR符合率为93.3%;对临床18份疑似GPV病例进行检测,LPA和PCR符合率为94.5%。表明LPA具有简便、快速、特异、准确等优点,适用于基层快速诊断番鸭小鹅瘟病。     

番鸭小鹅瘟病直接荧光诊断试剂的研制

将抗番鸭GPV单抗腹水采用透析法标记异硫氰酸荧光素（FITC）,制备成抗GPV荧光抗体,研制检测GPV抗原的直接免疫荧光诊断方法。结果显示GPV荧光抗体仅与GPV阳性的组织切片或细胞呈现特异性荧光,与番鸭细小病毒（MPV）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、鸭副粘病毒（DPMV）、鸭病毒性肝炎病毒（DHV）和正常番鸭组织切片不反应;与间接荧光方法的符合率为92．9％。表明GPV荧光抗体具有较好的特异性、敏感性和准确性,可用于临床快速诊断番鸭小鹅瘟病。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因在毕赤酵母中表达

将番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC蛋白基因与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9Kσ-C,转化大肠杆菌DH5α,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9Kσ-C用内切酶SacⅠ线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合,采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了高效表达,并且具有免疫反应性。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEV N基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法.应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1 168 bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株序列的同源性为95%～97%;敏感性测定结果为可扩增到18 pg的TGEV N基因cDNA.结果表明,建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查.     

番鸭呼肠孤病毒强弱毒株对番鸭免疫器官形态学的影响

本文探讨番鸭呼肠孤病毒强弱毒株对番鸭免疫器官超微结构的影响。强毒株感染番鸭显微结构变化表现为:各器官不同程度变性、细胞溶解坏死及血管扩张充血,病灶区及血管周围淋巴单核细胞明显浸润;免疫器官脾、胸腺和法氏囊淋巴细胞变性坏死,数量明显减少。脾脏淋巴细胞坏死,数量减少,网状结缔组织显露。而弱毒疫苗株接种后番鸭胸腺、法氏囊、脾脏组织学形态与健康对照鸭一致,均未发现在显微结构上的损伤。表明番鸭呼肠孤病毒强毒严重损伤免疫器官,而弱毒不仅失去对雏番鸭的致病性,而且也失去了损伤免疫器官和免疫抑制能力。     

番鸭呼肠孤病毒σC蛋白模拟抗原表位的研究

以番鸭呼肠孤病毒MW9710分离株原核表达蛋白pGEX-4T-1-σC为靶分子,利用噬菌体随机七肽库进行亲和筛选,经过4轮亲和筛选后,对整个被选噬菌体集合单链DNA进行测序。结果:噬菌体展示序列为CATCCTATTCATCCGCGTCAT,相应的短肽序列为HPFYSCY,该短肽序列与MDRVσC氨基酸序列N端一处-P-YS--的氨基酸片段相似,推论MDRVσC的模拟抗原表位可能是由该不连续氨基酸片段所构成的构象表位。通过Genbank的蛋白质检索,发现该构象表位也存在于前B细胞克隆增强因子的多肽序列中。结果表明,噬菌体展示随机肽库技术是一种用于研究抗原表位结构的有效方法。     

新型鸭呼肠孤病毒σB和σC蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)NP03株重组σB和σC蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测NDRV抗体的间接ELISA方法。优化后的最佳条件为:σB蛋白包被浓度为12.5μg·mL~(-1);σC蛋白包被浓度为6.25μg·mL~(-1);封闭液为15%FBS;血清稀释度为1∶80;酶标二抗稀释度为1∶400;底物37℃显色5min。该方法对MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。该方法与NDRV全病毒间接ELISA相比较,符合率高达92.5%。本研究进一步丰富了NDRV抗体的检测方法。