草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估

为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14～20 cm,体质量60～120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。     

丝毛乌骨鸡和北京油鸡超氧化物岐化酶活性比较研究

本文采用NBT比色法检测了丝毛乌骨鸡和北京油鸡间不同性别、不同组织的超氧化物歧化酶(SOD)活性 ,结果表明 ,两品种各组织SOD活性的高低顺序是肾 >肝 >脾、胰 >肌肉 ;♂个体各组织SOD活性略高于♀个体各相应组织 ;在♂个体比较中 ,北京油鸡各组织SOD活性略高于丝毛乌骨鸡各相应组织 ;而在♀个体比较中 ,北京油鸡各组织SOD活性略低于丝毛乌骨鸡各相应组织。     

嗜水气单胞菌溶血毒素对草鱼血细胞的溶血作用

通过嗜水气单胞菌菌体和菌液上清对草鱼的体外溶血试验,发现菌细胞在培养 12hr后即具最高溶血活性,而菌液上清在菌培养 60hr后才达到最高溶血活性;在 pH6～ 8范围内嗜水气单胞菌溶血素可维持高溶血活性,而维持高溶血活性的最适培养温度为 35℃;部分糖和二价金属盐类可在不同程度上影响菌液上清的溶血活性。     

抑制类胰岛素肽BBX-B8基因的表达对家蚕抗逆性的影响

家蚕类胰岛素肽(bombyxin)具有调节糖代谢、促进翅芽和造血器官细胞增殖、调控前胸腺分泌活性等功能。为探讨家蚕类胰岛素肽其它的生理功能,将Bombyxin B家族的BBX-B8基因克隆进pGEM-T载体,通过体外转录合成BBX-B8 dsRNA,研究RNAi介导的BBX-B8基因沉默对蚕体耐高温、低温和饥饿的能力及部分保护酶活性的影响。Western blotting检测显示,给家蚕5龄2d幼虫注射1μg/μLBBX-B8 dsRNA(10μL/头)3d后,脑组织中BBX-B8的表达水平下降30.80%。给家蚕5龄3d幼虫注射1μg/μLBBX-B8 dsRNA(10μL/头)2d后,血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)分别提高17.81%、41.86%,而过氧化氢酶(CAT)活性与对照无显著差异。给家蚕5龄3d幼虫注射BBX-B8 dsRNA 2d后进行高温(40℃,3h)和低温(4℃,3h)冲击,化蛹率比对照提高12.76个百分点;注射BBX-B8 dsRNA后禁食处理,在饥饿状态下的化蛹率比对照低9.29个百分点。研究结果提示:在家蚕5龄幼虫期抑制BBX的表达,可刺激血液中SOD活性上升,增强蚕体抗氧化能力,从而产生一系列生理应激反应,导致其对高温和低温的应激能力提高;家蚕的代谢活动加剧,能量消耗增加,耐饥饿能力下降。     

南美白对虾养殖环境及其肠道细菌多样性分析

为了探讨南美白对虾(Penaeus vannamei Boone)肠道及其养殖环境中细菌种群组成和分布,采用Illumina miseq测序平台,基于16S r RNA基因的序列测定结果,对南美白对虾肠道及其养殖池塘底泥、水体中细菌的种群结构进行分析。结果显示,在南美白对虾肠道、养殖池塘底泥、水体分别检测到206、265和270个细菌属,其中,有90个属在3个样品中均可检测到,底泥和水、底泥和虾肠道、水和虾肠道中检测到的共有细菌属分别为146、128和119个,表明养殖池塘底泥、水和肠道中细菌存在密切的相互作用。在底泥、水和虾肠道样品中丰度大于1%的优势菌属分别有20、17和10个;底泥、水体和虾肠道中丰度最高的细菌均为一种分类未明的细菌属,丰度分别为23.08%、37.13%和42.22%。除此之外,底泥中主要优势细菌属分别为假单胞菌属(Pseudomonas)(5.77%)、Ohtaekwangia(4.79%)和狭义的梭菌属(Clostridium)(3.88%);水体中主要优势细菌属分别为土壤杆菌属(Sediminibacterium)(6.64%)、Spartobacteria genera incertae sedis(3.95%)和GPIIa(3.20%),而虾肠道中主要优势细菌属分别为假单胞菌属(Pseudomonas)(14.57%)和不动杆菌属(Acinetobacter)(6.54%)。在底泥、水和肠道中分别检测到3、6和6个潜在致病细菌属,丰度最高的细菌属分别是假单胞菌属(5.77%)、黄杆菌属(Flavobacterium)(0.77%)和假单胞菌属(14.57%)。在底泥、水和肠道中检测到的益生菌可分别分配至8、6和7个细菌属,其中有5个属在3个样品中均可检测到。聚类分析显示,养殖池塘底泥、水体和南美白对虾肠道细菌种群中丰富度位于前20的分类操作单元(OUT)在聚类树的位置存在明显不同。研究结果进一步加深了对健康南美白对虾肠道细菌种群及其与养殖环境中细菌种群互作的理解,为益生菌制剂的研发提供了新的线索。     

构建稳定转化的BmN细胞表达人白介素-28A及表达产物的体外抗肿瘤活性

为建立能表达人白介素-28A(hIL-28A)基因的稳定转化家蚕卵巢细胞(BmN)系,构建了重组表达载体pIZT/V5-His-hIL-28A并转染BmN细胞,采用终浓度为300～400μg/mL的博莱霉素(zeocin)筛选2个月后,获得了稳定转化BmN细胞系。SDS-PAGE和Western blotting检测显示在稳定转化BmN细胞中表达的重组hIL-28A蛋白分子质量约为26kD;用ELISA试剂盒测定hIL-28A的表达水平约为2.035×10-5ng/个细胞。用噻唑蓝法(MTT法)检测hIL-28A的体外抗肿瘤活性,结果显示其对肺癌细胞A549、急性早幼粒细胞白血病细胞HL60、肝癌细胞BEL-7402和乳腺癌细胞M231的半数抑制浓度(IC50)分别为3.21、2.84、6.29和9.32ng/mL。研究结果表明hIL-28A可在稳定转化BmN细胞中表达,表达产物具有体外抗肿瘤活性。     

小菜粉蝶颗粒体病毒lef-3基因的克隆与分析

 【目的】研究杆状病毒lef-3基因的起源与进化,从分子水平明确病毒之间的亲缘关系。【方法】通过常规PCR方法获得小菜粉蝶颗粒体病毒晚期基因表达调控因子lef-3的基因片段,克隆后测序,然后利用软件对lef-3及编码序列进行生物信息学分析。【结果】克隆得到的PiraGV lef-3基因ORF序列中存在4个突变位点,但氨基酸性质未发生改变,推导PiraGV LEF-3蛋白含399个氨基酸残基,分子量为3.99 kD;通过高级结构预测及其编码序列与其它杆状病毒的LEF-3同源性比对表明,该基因可能编码单链DNA结合蛋白;BLAST比对发现lef-3基因只存在于鳞翅目昆虫为宿主的杆状病毒基因组;进化分析表明LEF-3可分为3组,其中GV属的LEF-3聚类为1个组,NPV属的LEF-3聚类为2个组;GV的lef-3基因编码区的选择压力分析表明,大多数lef-3基因间相比较表现为负向选择,但不同lef-3基因间的Ka/Ks不同,也有正向选择;起源分析表明,杆状病毒lef-3基因可能来源于细菌。【结论】获得了小菜粉蝶颗粒体病毒（PiraGV）lef-3基因,通过生物信息学分析推测出了lef-3基因的起源进化规律。     

桑叶芽萌发期附生丝状真菌分析

本文通过选择培养基固体平皿法选择培养桑叶芽萌发各期的附生丝状真菌,并对其主要种类进行镜检归类分析。结果表明,春季萌发时,在叶芽的露青期至展叶期共检出11个属的丝状真菌,其中含量较高的菌分属于毛霉属和弯孢属,并检测到刀孢属和光壳炱属的菌。夏伐后由潜伏芽刚萌发的叶片附生丝状真菌的类型比春季萌叶叶表的菌类型稍少,并以毛霉属和青霉属的菌为主。     

家蚕核型多角体病毒碱性磷酸酶基因(alk-exo)与杆状病毒的分子进化分析

基于为杆状病毒分类提供新的依据,克隆了家蚕核型多角体病毒苏州株(BmNPV-SU)碱性核酸酶基因(alk-exo)及其侧翼区,并进行序列和进化分析。BLAST检索显示,BmNPV-SUalk-exo上游的部分ORF109序列仅在AcNPV、RoNPV中检索到同源序列;下游区域在AcNPV、RoNPV、SlNPV的基因组中检索到同源序列。序列分析表明,BmNPV-SU的alk-exo基因编码420个氨基酸残基,下游区域存在2个正向的重复。比对结果分析显示,在22种杆状病毒中,alk-exo基因间核苷酸序列和氨基酸序列的同源性不高,变异较大。同时,利用MEGA软件包中的UMEGA算法建立了基于alk-exo基因的分子进化系统树,表明通过杆状病毒的进化可以反映宿主昆虫的进化,杆状病毒与其宿主昆虫之间存在共进化关系。     

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。