草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。     

家蚕drk基因的克隆及生物信息学分析

受体下游激酶( downstream of receptor kinases,DRK)是JAK/STAT信号途径的重要组成成员,在信号传导中发挥重要作用.为了研究家蚕的JAK/STAT途径,本研究通过RT - PCR克隆了家蚕的drk基因(Bmdrk)的cDNA,序列测定结果显示:Bmdrk开放读码框为639 bp,编码212个氨基酸残基.结构分析显示:BmDRK由SH3和SH22种结构域形成了SH3 -SH2 -SH3的结构形式.基于SH3 - SH2 -SH3结构域序列的进化分析指出昆虫DRK蛋白序列高度同源,结构与基本功能相似.DRK在进化过程有侧翼1个SH3结构域丢失的事件发生.研究结果为探讨Bmdrk在JAK/STAT信号途径中的作用方式以及drk基因进化提供了新的线索.     

小菜粉蝶颗粒体病毒lef-3基因的克隆与分析

 【目的】研究杆状病毒lef-3基因的起源与进化,从分子水平明确病毒之间的亲缘关系。【方法】通过常规PCR方法获得小菜粉蝶颗粒体病毒晚期基因表达调控因子lef-3的基因片段,克隆后测序,然后利用软件对lef-3及编码序列进行生物信息学分析。【结果】克隆得到的PiraGV lef-3基因ORF序列中存在4个突变位点,但氨基酸性质未发生改变,推导PiraGV LEF-3蛋白含399个氨基酸残基,分子量为3.99 kD;通过高级结构预测及其编码序列与其它杆状病毒的LEF-3同源性比对表明,该基因可能编码单链DNA结合蛋白;BLAST比对发现lef-3基因只存在于鳞翅目昆虫为宿主的杆状病毒基因组;进化分析表明LEF-3可分为3组,其中GV属的LEF-3聚类为1个组,NPV属的LEF-3聚类为2个组;GV的lef-3基因编码区的选择压力分析表明,大多数lef-3基因间相比较表现为负向选择,但不同lef-3基因间的Ka/Ks不同,也有正向选择;起源分析表明,杆状病毒lef-3基因可能来源于细菌。【结论】获得了小菜粉蝶颗粒体病毒（PiraGV）lef-3基因,通过生物信息学分析推测出了lef-3基因的起源进化规律。     

嗜水气单胞菌血毒素对草鱼血细胞的溶血作用

通过嗜水气单胞菌菌体和菌液上清对草鱼的体外溶血试验,发现菌细胞在培养１２ｈｒ后即具最高溶血活性,而菌液上清在菌培养６０ｈｒ后才达到最高溶血活性;在ｐＨ～８范围内嗜水气单胞菌溶血素可维持高溶血活性,而维持高溶血活性的最适培养温度为３５℃;部分糖和二价金属类可在不同程度上影响菌液上清的溶血活性。     

食用菌脲酶活性研究

本文以２２种食用菌为材料,应用两种不同培养基培养,通过比色法分别检测菌丝和培养液脲酶活性,结果显示各种食用菌菌丝脲酶活性远远高于培养液,各种菌丝间脲酶活性存在较大差异,而两种不同培养基对食用菌脲酶活性的影响也存在个体差异。在２２种食用菌中,金针菇１０７菌丝的脲酶活性最高。     

构建稳定转化的BmN细胞表达人白介素-28A及表达产物的体外抗肿瘤活性

为建立能表达人白介素-28A(hIL-28A)基因的稳定转化家蚕卵巢细胞(BmN)系,构建了重组表达载体pIZT/V5-His-hIL-28A并转染BmN细胞,采用终浓度为300～400μg/mL的博莱霉素(zeocin)筛选2个月后,获得了稳定转化BmN细胞系。SDS-PAGE和Western blotting检测显示在稳定转化BmN细胞中表达的重组hIL-28A蛋白分子质量约为26kD;用ELISA试剂盒测定hIL-28A的表达水平约为2.035×10-5ng/个细胞。用噻唑蓝法(MTT法)检测hIL-28A的体外抗肿瘤活性,结果显示其对肺癌细胞A549、急性早幼粒细胞白血病细胞HL60、肝癌细胞BEL-7402和乳腺癌细胞M231的半数抑制浓度(IC50)分别为3.21、2.84、6.29和9.32ng/mL。研究结果表明hIL-28A可在稳定转化BmN细胞中表达,表达产物具有体外抗肿瘤活性。     

家蚕vasa样基因表达的可变剪接

VASA样蛋白是决定生殖系发育的重要调控蛋白因子之一,具有广泛的保守性,因此vasa的表达被认为是生殖细胞中最可靠的分子标记。为研究家蚕vasa样基因(Bombyx mori vasa-like gene,Bmvlg)的基本结构特征,通过RT-PCR从家蚕雄性性腺组织中获得了4个不同长度的BmvlgcDNA片段。经克隆分析,其中一个完整的BmvlgcD-NA全长1 806 bp,编码全长601个氨基酸的家蚕VASA样蛋白,该蛋白的结构特征与已知同源VASA样蛋白的结构特征基本一致;另3个不同长度的BmvlgcDNA均有各自的起始密码子和终止密码子。推测Bmvlg基因可能存在着多种可变剪接。     

家蚕微粒子病药物治疗研究初探

TAAL对人工接种的家蚕微粒子病的实际治疗试验表明:以0.5-1mg/ml的TAAL1次/日,8小时/次药物添食,对家蚕微粒子病有明显的治疗效果.TAAL的疗效与治疗次数、二次用药的间隔时间、蚕体感染微孢子的数量、蚕体发病程度关系十分密切.治疗次数增加,疗效增加;二次用药间隔时间超过36小时疗效明显下降;蚕体感染微孢子浓度越低疗效越明显,当微孢子感染浓度低于10~8个孢子/毫升时表现出良好的效果.感染48小时前与48小时后使用TAAL的效果截然不同.推测该药物主要作用于微孢子原虫的裂殖体阶段.     

抑制类胰岛素肽BBX-B8基因的表达对家蚕抗逆性的影响

家蚕类胰岛素肽(bombyxin)具有调节糖代谢、促进翅芽和造血器官细胞增殖、调控前胸腺分泌活性等功能。为探讨家蚕类胰岛素肽其它的生理功能,将Bombyxin B家族的BBX-B8基因克隆进pGEM-T载体,通过体外转录合成BBX-B8 dsRNA,研究RNAi介导的BBX-B8基因沉默对蚕体耐高温、低温和饥饿的能力及部分保护酶活性的影响。Western blotting检测显示,给家蚕5龄2d幼虫注射1μg/μLBBX-B8 dsRNA(10μL/头)3d后,脑组织中BBX-B8的表达水平下降30.80%。给家蚕5龄3d幼虫注射1μg/μLBBX-B8 dsRNA(10μL/头)2d后,血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)分别提高17.81%、41.86%,而过氧化氢酶(CAT)活性与对照无显著差异。给家蚕5龄3d幼虫注射BBX-B8 dsRNA 2d后进行高温(40℃,3h)和低温(4℃,3h)冲击,化蛹率比对照提高12.76个百分点;注射BBX-B8 dsRNA后禁食处理,在饥饿状态下的化蛹率比对照低9.29个百分点。研究结果提示:在家蚕5龄幼虫期抑制BBX的表达,可刺激血液中SOD活性上升,增强蚕体抗氧化能力,从而产生一系列生理应激反应,导致其对高温和低温的应激能力提高;家蚕的代谢活动加剧,能量消耗增加,耐饥饿能力下降。     

复配TAAL对家蚕微粒子病的治疗

２龄起蚕人工感染家蚕微孢子虫后，进行药物治疗，结果表明：同样浓度的ＴＡＡＬ的治疗效果优于多菌灵，用乳化剂８０１复配后的ＴＡＡＬ，其治疗效果更加明显。不同治疗时期复配ＴＡＡＬ的疗效明显不同，感染后７２小时施行治疗则体现不出治疗作用。５龄起蚕感染微孢子后，用复配ＴＡＡＬ进行治疗，其母蛾带毒率降低３０％左右。４龄起每日添食复配ＴＡＡＬ对原蚕的生长发育、茧质无不良影响。