可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建

【目的】构建能够感染家蚕和茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒（rBmNPV）,解决EoNPV扩增困难而不易获得的难题。【方法】通过Bac-to-Bac系统构建具备BmNPV的多角体蛋白基因（polh）表达盒和EoNPV的解旋酶基因（hel）表达盒的重组家蚕核型多角体病毒。【结果】家蚕或家蚕细胞扩增的rBmNPV可以感染茶尺蠖并致病,表明rBmNPV的宿主域拓展至茶尺蠖。【结论】成功构建了能够感染茶尺蠖的rBmNPV,为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂打下基础。     

团头鲂β-actin启动子在家蚕中活性分析

利用双式荧光报告基因检测团头鲂β-actin启动子在家蚕BmN细胞和在家蚕体内的活性。通过脂质体介导法将转基因载体pigA3GFPAβdsRed和辅助质粒(1∶3)混合均匀后转染BmN细胞,48h后,可以检测到同时发绿色荧光和红色荧光的家蚕细胞,表明来自团头鲂的β-actin启动子在家蚕BmN细胞具有活性,能驱动DsRed基因在家蚕BmN细胞中表达。以gfp、dsred的特异引物,可从pigA3GFPAβdsRed转化家蚕BmN细胞基因组内扩增出gfp、dsred相应大小的片段,提示外源基因已经插入到细胞基因组中。随着转化细胞的传代,绿色荧光稳定存在,而红色荧光会逐渐减弱直至检测不到,暗示β-actin启动子在家蚕细胞中容易受到家蚕BmN细胞因子的影响而活性减弱。将转基因载体pigA3GFPAβdsRed和辅助质粒(1∶3)利用精子介导法导入家蚕受精卵,7天后,在部分受精卵中可观察到绿色荧光和红色荧光,进一步证明了β-actin启动子在家蚕体内具有活性。结果显示,含双式荧光报告基因的转基因载体为鉴定β-actin启动子等外源启动子在家蚕中的活性提供了快捷准确的鉴定方法。     

BmNPV多角体对稳定转化细胞表达荧光蛋白的包埋现象初探

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体对外源蛋白的包埋特性,构建了含有绿色荧光蛋白基因(gfp)和红色荧光蛋白基因(DsRed)的表达载体pIZT-DsRed,用该载体转染家蚕卵巢细胞系(BmN),并以吉欧霉素(zeocin)筛选得到稳定表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的BmN细胞系。进一步以野生型BmNPV感染pIZT-DsRed转化BmN细胞,发现部分多角体可以发出绿色荧光和红色荧光,Western blot检测证明多角体中含有GFP蛋白,显示BmNPV多角体可以包埋进病毒粒子以外的其他蛋白成分,表明BmNPV多角体蛋白的包埋机制中存在非特异性识别包埋的现象。     

带毒蚕卵中的家蚕微孢子虫DNA提取方法研究

为促进用PCR法检测家蚕微粒子病的生产应用,对带毒蚕卵中的家蚕微孢子虫DNA提取方法进行了研究。结果表明,蚕卵经30%KOH、27℃预处理后抽提的核酸能满足PCR检测对DNA质量的要求。以该方法抽提的DNA为模板,进行蚕卵集团检测,结果10~100粒蚕卵中混有1粒“有毒”卵,即能用PCR的方法检测出。“1/100”“有毒”卵的检出概率约为80%。     

乙醇固定中华绒螯蟹组织的DNA提取方法

由于ＲＡＰＤ技术简单、灵敏度高、设备要求不高、工作成本低和研究周期短等优点,已经在生物、医学领域被广泛地使用。张德春等[1]曾提出可用于ＲＡＰＤ分析的鱼类血样乙醇保存方法。考虑到乙醇固定标本应用范围广,且乙醇对ＤＮＡ的保护作用明显、时间长等优点,笔者直接采用75%的乙醇固定中华绒螯蟹(Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｓｉｎｅｎｓｉｓ,河蟹)肌肉组织,初步研究了如何经乙醇固定的河蟹肌肉组织中提取ＤＮＡ的方法,作为进一步在分子水平研究河蟹基因的基本参考。以往未见有关这方面的研究报道。收稿日期:20000425基金项目:江苏省教委资助项目…     

中华绒螯蟹颤抖病的一种病原特性初步研究

病毒球状、无囊膜,大小为５５ｎｍ左右,病毒核酸有１２个基因组片段,为３／３／６型,总分子量２０ｋｂ左右。推测病毒核酸为ＲＮＡ,初步确定为呼肠孤病毒样病毒（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ Ｖｉｒｕｓ）。实验提示该病毒对温度有较强的敏感性。     

嗜水气单胞菌对鲫组织蛋白酶活性的影响

嗜水气单胞菌按是否产胞外毒素及毒素的类型分为高毒株和低毒株两大类。具高毒性的嗜水气单胞菌对水产养殖动物，包括各种淡水养殖的鱼类、甲壳类、爬行类等普遍具感染性，同时嗜水气单胞菌也能导致人类疾病。有关嗜水气单胞菌的分离、分类、毒性检测及对人类的致病性已有大量的报道和较深入的研究，但由于不同类型动物的生理差异，有关嗜水气单胞菌对水生动物生理的影响研究很少。本试验以淡水养殖的代表动物———鲫鱼为人工感染的实验对象，并以酪蛋白为酶作底物，检测鲫在人工感染产胞外毒素的嗜水气单胞菌及菌液上清后，其血清、肝、肾…     

家蚕类mariner转座子相关序列分析

通过PCR克隆,从家蚕基因组中获得大小为975bp的DNA片段(登录号:EU352872),Blast搜寻结果显示,该片段DNA序列的52-449nt区域与野蚕mariner-like元件DNA(登录号:AB237562)的同源性达90%,推测为家蚕类mariner转座子相关序列,在乙酰胆碱酯酶基因的第5内含子、微卫星S1104-R序列、BmBRC-NZ3 mRNA终止码的下游序列、ErB·1基因的内含子均检测到家蚕类mariner元件相关序列的同源区,暗示家蚕类mariner元件在家蚕基因组中发生了多次转座,并在家蚕基因组的不同区域随着进化发生了歧化。     

家蚕丝素重链基因（fib-H）部分序列克隆及结构分析

通过PCR分别克隆了1个包含家蚕丝素重链基因启动子及旁侧序列（1380bp）、丝素重链基因第1内含子和第2外显子的部分序列（956bp）的2个片段,并进行了序列测定和分析,结果显示：该2个片段与已公开的家蚕丝素重链基因（GenBank登录号：AF226688）对应区域的同源性分别达98．48％和99．58％;2级结构分析显示,在启动子区域存在大量简单的反向互补序列,可形成多个潜在的茎环结构,推测这些茎环结构可能与调控蛋白的识别和作用有关;将第2外显子对应的部分氨基酸序列与其他昆虫的丝蛋白进行比对分析,发现不同的丝蛋白在比对的区域具有潜在的守恒基序,其差异序列可能与丝蛋白的特性相关。     

家蚕热休克蛋白基因Bmhsp19.9启动子的活性分析

通过PCR扩增出家蚕(Bombyx mori)热休克蛋白基因Bmhsp19.9启动子的序列,TA克隆后进行序列测定,并构建重组载体进行瞬时表达.结果显示,该基因序列长为1 258 bp,具有典型的热激蛋白启动子的结构特点;序列分析显示,hsp19.9启动子区域可形成潜在的复杂茎环结构,推测其与启动子的功能有关.瞬时表达试验结果显示,hsp19.9的启动子能通过热诱导在家蚕BmN细胞和家蚕组织中驱动红色荧光蛋白报告基因(DsRed)瞬时表达,表明所克隆的hsp19.9启动子序列具有热休克蛋白基因的启动子活性.