杂交猪IL-2和IL-6全基因克隆及序列分析

为研究杂交猪白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素6(IL-6)在机体免疫应答中的作用,将杂交猪外周血淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下进行体外培养后,提取淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增出杂交猪淋巴细胞IL-2和IL-6的cDNA,克隆到pMD18-T载体上并测序.测序结果表明:杂交猪IL-2基因核苷酸序列与参考序列的同源性为100%;IL-6基因核苷酸序列与GenBank登录的参考序列的核苷酸同源性在99.8%～100%之间,推导氨基酸同源性在99.1%～100%之间.     

PRV、POV-2、PPV多重POR检测方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪Ⅱ型圆环病毒（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）核苷酸序列,设计并合成能分别特异性扩增PRV、PCV-2、PPV的引物。经条件优化,建立了同时检测PRV、PCV-2、PPV的多重PCR方法,所扩增特异性产物片段大小分别为217bp、394bp、748bp。该方法不仅特异性强、敏感性高,还克服了对上述病原分别进行检测所带来的诸多弊端,为猪伪狂犬病、猪Ⅱ型圆环病、猪细小病的,临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。     

犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子的原核表达

为筛选犬新孢子虫保护性抗原,克隆表达犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子(MIF)并对其免疫原性进行分析。根据GenBank公布的犬新孢子虫MIF(NcMIF)序列,利用分子生物学软件设计2套特异性引物,以NcMIF mRNA反转录产物为模版,采用PCR扩增出NcMIF基因和2种突变基因NcMIFm和NcMIFhis,选用原核表达载体pET26b,分别构建重组质粒pET26b-NcMIF和pET26b-NcMIFm。重组质粒分别转入E.coli BL21(DE3)中进行表达,纯化后的蛋白利用免疫印迹法进行鉴定。结果显示,rNcMIF和rNcMIFm这2种重组蛋白在BL21(DE3)表达菌株中均为可溶性表达,诱导表达最佳条件为30℃诱导3h IPTG诱导浓度为1mmol/L;Western blot分析结果表明,该表达产物能与抗rNcMIF绵羊血清发生反应,说明获得的蛋白具有较好的抗原性和特异性。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PPV)VP2基因的重组腺病毒表达载体。将VP2基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV上,并将重组质粒pShuttle-CMV/VP2用Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-VP2,为进一步研究PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

黄河三角洲优良地方畜禽品种特性及其综合开发利用

畜禽品种资源是一种独特的生物资源,是畜牧业可持续发展的重要前提和人类赖以生存和发展的重要基础。黄河三角洲地区是渤海黑牛、德州驴、鲁北白山羊、洼地绵羊、寿光鸡等优良畜禽良种资源的原产地和主产区,其中渤海黑牛、德州驴列入国家级地方品种保护名录,洼地绵羊、鲁北白山羊列入省级地方优良品种保护名录。     

新型反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立

对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复性好的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与牛病毒性腹泻病毒及其他猪源病毒发生非特异反应。应用本试验建立的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法可以及早对猪瘟作出准确诊断,并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来,减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。     

猪圆环病毒2型特异性纳米抗体文库的构建及鉴定

为构建猪圆环病毒2型(PCV2)特异性纳米抗体文库,并对其库容和多样性进行鉴定分析,使用PCV2全病毒灭活疫苗免疫羊驼,经四次免疫后采血分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,通过RT-PCR反转录合成cDNA;根据羊驼重链抗体基因序列设计特异性引物,通过巢式PCR扩增羊驼单域重链抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因片段vhh,并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,构建pCANTAB- vhh重组质粒;通过电穿孔法将重组质粒导入E. coli TG1获得抗PCV2特异性纳米抗体基因文库。文库菌梯度稀释后计数单克隆菌落数,并通过菌液PCR鉴定重组菌阳性率,计算抗体文库库容量;对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,分析抗体文库多样性。结果显示,构建的PCV2特异性纳米抗体文库重组菌阳性率为92.0%,库容量为2.75×10¹⁰ CFU/mL;测序后序列比对分析结果表明,纳米抗体文库包含的基因序列具有丰富的多样性。本研究成功构建了PCV2特异性纳米抗体文库,且文库质量满足后续试验要求,为进一步获得针对PCV2抗原的纳米抗体奠定了基础。     

猪链球菌Sao-M和IdeSsuis蛋白的原核表达与反应原性分析

通过原核表达系统表达猪链球菌Sao-M和Ide_(Ssuis)基因,并分析其反应原性。根据GenBank数据库发表的序列,利用分子生物学软件设计了2对特异性引物,通过PCR扩增Sao-M和Ide_(Ssuis)基因,经测序分析后,分别克隆到pET28a(+)和pMAL-c2X,构建重组表达质粒pET28a:Sao-M和p MAL-c2X:Ide_(Ssuis),然后将鉴定为阳性的重组质粒分别转入宿主菌BL21和Rosetta2中用IPTG进行诱导表达,通过免疫印迹进行鉴定。实验表明,两种重组蛋白在原核系统中获得了高效的表达,并能与相应的阳性抗血清发生特异性反应。本研究为进一步探究Sao-M和Ide_(Ssuis)蛋白生物学功能及其在猪链球菌致病机制上的作用提供了依据。     

某猪场爆发高致病性猪繁殖与呼吸综合征的诊断

2007年6月份,某猪场爆发一起以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,临诊症状主要表现为高烧、皮肤发红、怀孕母猪流产,剖检主要特征是间质性肺炎。经过病原分离,获得一株能够引起Marc-145细胞发生病变的病毒。进一步通过血清中和试验、血凝试验、RT-PCR,确定此次分离的病毒为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。综合该病的流行病学特征、临床症状、剖检病理变化以及实验室检验,确诊该病为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征。