猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接,构建重组质粒pAc-GFP-dN。将pAc-GFP-dN转染于Vero E6细胞中,利用激光共聚焦显微镜分析重组质粒pAc-GFP-dN表达蛋白的定位情况,并利用流式细胞仪检测转染细胞的周期变化。实验结果表明:与完整的N蛋白相比,缺失核仁定位信号的N蛋白不能定位于细胞核仁,同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力,从而揭示了N蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响。     

猪传染性胃肠炎病毒NSP8蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的初步鉴定

为鉴定猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)NSP8蛋白的抗原表位,本研究对GST-NSP8重组蛋白进行了原核表达,并用纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾脏,采用常规杂交瘤细胞融合方法,经3次亚克隆后制备了1株稳定分泌抗NSP8蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。分泌的单克隆抗体亚类鉴定其重链为IgG1型,轻链为κ链;杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶3 200。Western blotting试验结果表明该单克隆抗体能识别原核及真核表达的NSP8重组蛋白。利用截短表达的方法对NSP8蛋白进行抗原表位的鉴定,初步确定了单克隆抗体针对的抗原表位序列为31SPQILKQLTKAFNIAKSDFEREASV55。本研究制备的单克隆抗体及对抗原表位的鉴定,为TGEV NSP8蛋白相关功能的研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立

本研究以纯化的原核表达猪传染性胃肠炎病毒N蛋白为诊断抗原，建立了猪传染性胃肠炎病毒抗体检测的间接ELISA诊断方法，将其命名为mTGE-ELISA。该抗原不与其他常见10种猪病的阳性血清发生交叉反应。批内和批间重复性试验的变异系数均小于15％；对仔猪免疫后不同时间的血清检测结果表明mTGE-ELISA与纯化病毒ELISA符合率达95．0％；mTGE-ELISA相对于VN试验的敏感性为96．3％、特异性为92．2％：现地试验中，mTGE-ELISA与Svanova TGEV／PRCV antibody diagnosis Kit的符合率达87．0％，通过中和试验复核结果表明，mTGE-ELISA的假阳性低于Svanova TGEV／PRCV antibody diagnosis Kit。本试验建立的mTGE-ELISA诊断方法具有良好的敏感性和特异性，为免疫猪群抗体监测和TGE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪圆环病毒Ⅱ型引起的断乳仔猪全身性消瘦综合征

猪圆环病毒(PCV)主要侵犯机体的免疫系统,可引起断奶仔猪全身性消瘦综合征(PMWS),其临床症状主要表现为进行性呼吸困难,消瘦,体表淋巴结肿大,腹泻,黄症,贫血,导致死亡.     

A群猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

To prepare the monoclonal antibodies against VP7 protein of group A porcine rotavirus (PoRV) serotype G11,VP7 gene of PoRV serotype G11 was cloned into the vector pGEX-6P-1. The recombinant plasmid was transformed into E.coli competent cells DH5α and induced by IPTG. Hybridomas were produced by fusing SP2/0 cells with spleen cells from mouse immunized with GST-VP7 recombinant protein. One hybridomas secreting MAb against VP7 protein was identified by indirect ELISA. Western blotting analysis showed that the MAb could recognize the recombinant VP7 protein and authentic VP7 protein of PoRV,and the specific immunoflurescence was detected in PoRV infected MA104 cells by indirect immunoflurescence assay.The result of MTT method showed that the MAb had the neutralizing activity. The subtype of the MAb was IgG2b. The results showed that VP7 protein was successfully expressed in E.coli, one MAb was preparated and identified,and it could be used for further study of prevention,diagnosis and treatment of porcine rotavirus disease.     

猪轮状病毒OSU强毒株vp7基因的克隆及其抗原表位原核表达和免疫学活性分析

参照GenBank中所收录的猪轮状病毒OSU株序列设计了一对特异性引物,RT—PCR扩增出1062bp的vp7全长基因,与参考OSU序列的核苷酸同源性达99．8％,克隆到pMD18-T载体中,获得pMD18-T—vp7阳性质粒。以阳性质粒为模板,利用引入BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增得到含有vP7中和抗原表位区域639bp的基因片段,定向克隆到表达载体pGEX-6P—1中,经酶切PCR鉴定的阳性质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG（终浓度为1．0mmol／mL）37℃诱导4h后,SDS—PAGE电泳显示表达了大小约50ku带GST标签的融合蛋白,薄层扫描显示蛋白表达融合量占菌体总蛋白的33．2％。Westernblot分析表明该VP7重组蛋白可与PRV阳性血清特异性反应。     

猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展

猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上培养成功后,病毒全基因组的序列和分子结构特征,结构蛋白和非结构蛋白的生物学特性和功能,病原学、血清学和分子生物学的诊断技术,体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫的机理,疫苗和病毒的细胞受体等方面得到了广泛的研究。但是,与其他冠状病毒相比,猪流行腹泻病毒的研究还比较滞后,许多研究还没有开展或不够深入,为了能加快对猪流行性腹泻病毒研究进程,对其最近的分子生物学研究进展做了综述,为猪流行性腹泻病毒的深入研究提供参考。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白中和表位区单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白中和表位(SID)重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了6株稳定分泌抗SID区特异性的单克隆抗体细胞株,分别命名为2C4、3G3、5F8、3G5、6E6和3C3。6株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价分别为1∶51200、1∶6400、1∶12800、1∶6400、1∶51200和1∶25600。免疫球蛋白类型均为IgG1型,轻链均为Κ链。Western blot试验结果显示,6株单克隆抗体均能特异性地识别天然PEDV中的S蛋白。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6核仁蛋白Fibrillarin的亚细胞定位分析

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征.本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因,并将其克隆于真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed-Fib.将pDsRed-Fib与本实验室构建的含有PEDV N基因的重组质粒pAcGFP-N,共转染Vero E6细胞.Western blot结果表明fibrillarin及N融合蛋白在转染的Vero E6细胞中均获得表达;利用共聚焦显微镜观察显示在共转染Vero E6细胞中PEDV N蛋白与Vero E6细胞核仁中的fibrillarin发生共定位.该结果为进一步研究PEDV和核仁蛋白相互作用奠定基础.