禽流感农业科技成果转化资金项目成效显著

“禽流感灭活疫苗产业化前期关键技术研究及中试”项目是2001年农业科技成果转化资金资助的第一批项目之一，该项目于2004年4月3日顺利通过验收。经过2年多的实施，该项目核心技术和生产条件均已成熟，项目熟化的产品对我国预防和控制禽流感发挥了巨大的作用。     

某复方中药抗禽流感病毒的免疫机制

通过SPF鸡服用某复方中药后,了解免疫器官指数、外周血液中CD 3、CD 4、CD 8及TCR 1T淋巴细胞百分比含量及IgG的变化,探索某复方中药对禽流感病毒作用的免疫机理.结果表明:给药组免疫器官指数、外周血液中CD 3、CD 4、CD 8及TCR 1 T淋巴细胞百分比含量及IgG均比对照组高.所以,该复方中药可促进SPF雏鸡免疫器官的发育和迅速成熟,提高SPF鸡的细胞免疫及体液免疫功能.     

两株H4N3禽流感病毒全基因组序列分析及对小鼠的致病性研究

2009年在我国南方活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到2株H4N3亚型禽流感病毒(AIV),DK/FJ/S1419/09(H4N3)(FJ/419/2009)和DK/HUN/S1010/09(H4N3)(HuN/010/2009)。为了解这2株H4N3亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行全基因组分析及对小鼠致病性研究。结果显示:其HA基因来源于近两年流行的H4亚型病毒株,NA基因来源于其它亚型病毒株。内部基因来源较复杂,与FJ/419/2009内部基因同源性最高的病毒株均来自国内H5、H6等亚型分离株,但与HuN/010/2009同源的内部基因则差异较大,与PA、M和NS同源性最高的病毒株分别为A/wild/duck/Korea/UP122/2007(H1N1),A/muscovy/duck/Thailand/CU-LM1983/2009(H4N6)and A/avian/Japan 8KI0068/2008(H3N6)。用106EID50病毒剂量感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示试验组小鼠感染后第3 d采脏器样品,仅在鼻甲和肺部能检测到病毒存在。以上数据表明,尽管这2株H4N3特殊亚型组合病毒来源复杂,但对小鼠的致病性较低。     

H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。     

禽流感综合防控

高致病性禽流感是世界动物卫生组织（OIE）规定的必须报告的动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。该病的暴发和流行不仅会给养禽业造成巨大的经济损失,而且还严重威胁着人类健康和社会稳定。     

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒(AIV)NA基因，克隆入pMD18-T载体中，再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9k中，构建了重组转移载体pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GSll5和筛选高拷贝重组转化子及筛选His^ Mut^ 表型转化子后，摇瓶培养，10mL／L甲醇诱导表达后，经SDS-PAGE、Western-blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明，获得了几株高效表达重组表达株，并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。     

重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对商品肉鸡的免疫效力研究

为评估重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对商品肉鸡的免疫保护效果,本研究将该疫苗按照现地免疫程序分别接种10日龄白羽肉鸡和14日龄黄羽肉鸡,疫苗接种前和接种后每周采血,分离血清,检测H5亚型Re-8株和H7亚型H7-Re1株禽流感病毒(AIV)HI抗体滴度,并在初次免疫后3周和出栏时以鼻腔感染方式分别进行攻毒试验。结果显示,免疫前,所有肉鸡血清中H7亚型H7-Re1株AIV HI抗体滴度均低于1log2,H5亚型Re-8株AIV平均HI抗体滴度分别为5.3log2(白羽肉鸡)和4.1log2(黄羽肉鸡);一次免疫的白羽肉鸡在免疫后3周至出栏时,2种亚型AIV平均HI抗体滴度在6.0log2~6.7log2;2次免疫的黄羽肉鸡在初次免疫后3周至出栏时,2种亚型AIV平均HI抗体滴度均在6.0log2以上。在一次免疫后3周时和出栏时,采用高致病性H5、H7亚型AIV攻毒后,对照组白羽肉鸡和黄羽肉鸡均全部死亡,免疫组白羽肉鸡和黄羽肉鸡均不发病、不排毒、不死亡,获得100%的免疫保护。本研究结果表明,重组AIV二价灭活疫苗对商品肉鸡具有良好的免疫效果,为该疫苗的现地应用提供了参考依据。     

PB2蛋白E627V突变可增强H7N9病毒对小鼠的致病力

【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来,研究发现其对家禽均呈现低致病力,对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是,2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒(简称HuN/S40726),却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分析、推测导致该病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。【目的】为了揭示该病毒致病力的变化原因以及对哺乳动物致病性增强的机制,提供人类H7N9病毒感染、危害增强风险预警,展开该研究。【方法】选取2013年低致病性H7N9病毒代表株(简称SH/S1053)和上述湖南HuN/S40726病毒,开展了哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析。然后以HuN/S40726病毒为模式毒株,利用反向遗传学技术,成功建立了病毒的反向遗传操作系统;利用基因点突变技术定点突变了HuN/S40726病毒PB2蛋白的627位氨基酸,救获了重组病毒r HuN/S40726、r HuN/S40726-PB2/627E和r HuN/S40726-PB2/627K。通过小鼠感染模型评估了以上3株重组突变病毒对哺乳动物的致病力,分析了PB2蛋白627位氨基酸的突变对小鼠致病力的差异。然后通过构建HuN/S40726病毒及其突变病毒的聚合酶复合表达质粒系统,以SH/S1053病毒为背景毒株构建聚合酶复合表达质粒系统作为对照,使用双荧光素酶法检测了PB2蛋白627位氨基酸的不同突变体在293T细胞中的聚合酶活性,进一步分析PB2蛋白627位氨基酸影响病毒毒力的内在机制。【结果】通过哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析,推测导致HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。重组救获病毒和突变株对小鼠致病性试验结果显示,PB2蛋白E627V的改变显著的增强了HuN/S40726病毒对小鼠的致病力,使得病毒MLD50由≥6.5 log10EID50变化为3.5 log10EID50,病毒毒力增强了至少1 000倍以上。聚合酶活性试验结果表明,无论是在33℃还是37℃下,PB2蛋白E627V的改变,显著提高了HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,与病毒对小鼠的致病性增强呈正相关性。【结论】PB2蛋白627位氨基酸(V)决定了HuN/S40726病毒对小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改变能够显著增强HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,是引起HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力的重要因素。     

H7N9流感病毒人源分离株与禽源分离株复制特性研究

为了解H7N9流感病毒的生物学特性,本研究对H7N9流感病毒人源分离株(AH1)和禽源分离株(CK53)复制特性进行了系统比较研究。序列分析显示,AH1和CK53病毒在进化关系上同源性较高,仅有8个氨基酸位点差异。两株病毒分别接种禽类细胞DF1和CEF,人类细胞A549和Calu-3,检测其复制能力,结果显示在33℃和37℃两种温度条件下,两种病毒在禽类细胞中复制能力相似,但在人类细胞中AH1复制能力强于CK53。CK53在哺乳动物细胞连续培养5代后出现包含PB2/E~(627)K在内共5个氨基酸位点的突变,显示禽源分离株在哺乳动物细胞复制过程中可以迅速获得适应性突变。突变病毒CK53-P5在A549细胞中复制水平明显强于CK53,其复制能力与AH1差异不明显。本研究进一步揭示了H7N9流感病毒人源分离株与禽源分离株的生物学特性差异,为深入了解其致病分子机制提供了实验依据。     

两株鸭源H5N1亚型禽流感病毒的序列分析及致病性研究

本研究对2010年在湖北活禽市场监测分离到的两株鸭源H5N1亚型禽流感病毒(AIV) (HuB/495/10和HuB/513/10)进行了序列分析和致病性试验研究,以了解湖北地区H5N1亚型AIV的生物学特性差异.序列分析显示:2株病毒全基因组核苷酸同源性在97.3 ％～98.6％,2株病毒的8个节段基因均与青海和香港分离的野鸟源病毒A/great crested-grebe/Qinghai/1/2009 (H5N1)和A/black-crowned night heron/Hong Kong/659/2008 (H5N1)的核苷酸高度同源,HA蛋白裂解位点序列基序为341RRRKR345,呈现典型的高致病力分子特征.以105 EID50/100 μL病毒剂量感染4周龄SPF鸭发现:HuB/495/10和HuB/513/10对鸭的致死率分别为100％和20％,病毒在鸭体内呈全身性复制并可通过呼吸道和消化道向外排毒;不同滴度的病毒感染6周龄BALB/c小鼠,HuB/495/10和HuB/513/10的MLD50分别为1.38 log10 EID50和1.68 log10 EID50,对小鼠表现为高致病力,均在肺脏中高拷贝复制.