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PCR扩增并克隆在pUC18质粒中的类志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)A亚单位基因片段切出,按预定阅读框架插入到原核性表达载体pGEX-6p-1的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒ppGEX-A。重组粒导入大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析及Western-blot鉴定,表明重组菌能大量表达融合蛋白形成的SLT-ⅡeA,即SLT-ⅡeA蛋白与谷胱甘肽转移酶相连组成的蛋白质。本实验的研究结果,为进一步研究SLT-Ⅱe的生物学特性及研制仔猪水肿病业单位苗提供了有效的生物材料。 相似文献
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仔猪腹泻源大肠杆菌的PCR快速检测 总被引:3,自引:0,他引:3
仔猪腹泻是危害养猪业的重要疾病,尽管导致仔猪腹泻的原因非常复杂,但大肠杆菌是其主要病原已经明确.本研究根据GenBank登录的肠毒素ST1、ST2、LT1以及耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的基因序列分别设计特异性引物,建立了检测相应毒力因子的PCR方法.通过对已知毒力型参考菌株的扩增,证明了所建立的PCR方法能够特异鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和HPI+大肠杆菌.采集临床110例仔猪腹泻病例的直肠棉拭子样品.接种LB肉汤于37℃增菌培养4 h~6 h后,运用所建立的PCR方法进行检测,结果表明有55例(50%)为HPI+大肠杆菌感染,9例(8.18%)为HPI+大肠杆菌与ETEC混合感染,7例(6.37%)为ETEC感染.通过与细菌分离后鉴定的比较,证明该诊断方法具有速度快、检出率高的特点,适合于临床活体检测. 相似文献
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大肠杆菌F18ac菌毛FedA蛋白的表达与鉴定 总被引:5,自引:0,他引:5
根据已经发表的F18ac菌毛A亚单位的基因序列(FedA)设计一对引物,利用PCR技术从重组质粒T 8813A 中扩增到一段序列,并按预定的阅读框插入表达性质粒载体pGEX 6p 1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedA/ac,并转化大肠杆菌BL 21 获得重组菌PPFedA/ac。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该序列大小为456 bp,与已发表的FedA/ac结构编码序列完全一致。通过对菌体裂解物的SDS PAGE 分析以及Western blotting 鉴定,证明重组大肠杆菌PP FedA/ac的可以表达融合蛋白形式的FedA/ac (命名为GST FedA/ac),即FedA/ac蛋白(15.317 ku)与谷胱苷肽转移酶(27.335 ku)相连组成分子量为42.652 ku的融合蛋白。利用GST FedA/ac制备的兔抗GST FedA/ac 血清与大肠杆菌F107/86 株( F18ab )、2 134 P 株(F18ac )进行的玻板凝集试验呈现阳性反应,进一步表明了表达的正确性。 相似文献
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将采集的健康鸡抗凝血按常规方法分离外周血淋巴细胞并于体外培养24h后,加入不同剂量的新鱼腥草素钠(SNH),然后以MTT法测定SNH对淋巴细胞增殖的影响。结果显示,SNH在体外具有刺激淋巴细胞增殖的能力,而且其刺激淋巴细胞的能力与剂量有关,其中以终浓度为250mg/L效果最明显。为进一步探讨SNH在体内对动物免疫功能的影响,将120只非免疫健康鸡随机分为5组;其中第Ⅰ~Ⅲ组为试验组,分别注射不同剂量(4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg体重)的SNH;第Ⅳ组为白细胞介素对照;第Ⅴ组为疫苗对照;所有动物于14日龄以新城疫病毒La Sota株弱毒活疫苗进行第一次免疫,2周后加强免疫1次,并于第一次免疫后的第7d、14d、21d、28d、35d分别测定各组动物的外周血CD4^+/CD8^+淋巴细胞比值。结果表明,体内注射SNH具有提高外周血CD4^+/CD8^+淋巴细胞比值的作用,并与对照组差异显著(P〈0.05),且这种作用同样与给药剂量相关,其中以2mg/kg体重最为理想。 相似文献
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旨在利用原核表达系统高效表达具有抗病毒活性的可溶性重组猪干扰素α(soluble recombinant porcine interferon-α,srPoIFN-α)。通过PCR方法扩增姜曲海猪IFNα基因成熟肽序列,将其分别克隆至原核表达载体pCold-Ⅱ、pET22b、pET30a和pET30a-ELP中并在大肠杆菌中进行表达;通过Western blot结合Image J软件或BCA定量分析不同表达载体、密码子偏好优化、培养基类别、纯化方式等因素对猪干扰素α基因在大肠杆菌中可溶性表达的影响,鉴定提高srPoIFN-α表达的有利因素;利用VSV-GFP和PEDV检测srPoIFN-α的抗病毒活性。结果显示,原核表达载体pET30a、密码子优化、HB-PET自诱导培养基和磁珠纯化均能显著提高srPoIFN-α产量(P<0.001);srPoIFN-α有效抑制VSV-GFP复制的稀释倍数为2-8.1,与重组人干扰素α2b标准品的比活为1.71×108 IU/g,有效抑制PEDV复制的稀释倍数为2-10.29,抗P... 相似文献
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猪圆环病毒2型的血清学检测 总被引:2,自引:1,他引:1
以大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(PCV2)重组衣壳蛋白(His-CAP2)为抗原,通过方阵ELISA滴定,确定了His-CAP2的最适包被浓度为6.4μg·mL-1,待检血清稀释度为1:40,建立PCV2的血清流行病学的间接ELISA监测方法.通过对已知PCV2血清及其他病毒血清的试验,表明该ELISA方法具有良好的特异性.利用该方法对来自苏中地区不同猪场的175份血清样本进行检测,PCV2抗体阳性检出率为70.29%,与临床上PCV2感染导致猪群发病的实际情况相符合,证实了此方法临床应用的可行性. 相似文献
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3株HPI+大肠杆菌fyuA与int基因的检测及序列分析 总被引:1,自引:1,他引:0
在耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的基因中,fyuA编码鼠疫菌素受体与细菌的摄铁能力调节有关,int编码的整合酶与HPI在大肠杆菌基因组αsn-tRNA位点的整合相关.根据GenBank中已发表的HPI基因序列设计2对引物,分别用于fyuA和int的PCR扩增.将从3株仔猪腹泻源HPI+大肠杆菌(S70903株、S70925株、S70931株)中扩增的片段克隆至pGEM-Teasy载体,分别获得含有fyuA和int的重组质粒.琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明:所克隆的fyuA基因大小均为948 bp,与已发表序列的同源性为98.6%~100%.所克隆的int基因片段大小均为1 391 bp,与已发表序列的同源件为96.0%~99.6%.研究结果提示,这3株细菌的fyuA基因并没有因为HPI的转移而缺失或被修饰,并且均整合在大肠杆菌基因组口αsn-tRNA位点. 相似文献
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根据已发表的猪圆环病毒2基因序列设计1对PCR引物,用PCR方法从6株PCV2江苏分离株(YZ60615,YZ60721,YZ70717,TZ60607,TZ60804、YC60711)中扩增出相应的全基因组DNA片段。按常规方法克隆,获得6个含有相应片段的重组质粒。序列测定结果表明,6株病毒的基因组大小均为1 767 nt,与GenBank中已发表序列同源性为94.6%~100.0%。遗传进化分析表明,这6株江苏地区的病毒与浙江株(AY678532,AY691169,AY510375)、福建株(DQ180393)、江苏株(DQ104422)亲缘关系较近,与多数中国分离株亲缘关系较近并形成较大的一簇,而与美国株(AF264041)、加拿大株(AF086836)遗传关系较远。 相似文献