类圆环病毒因子P1感染对猪外周血单个核细胞抗病毒蛋白mRNA转录的影响

为探讨类猪圆环病毒2型因子P1感染对猪抗病毒蛋白分子mRNA转录的影响,将P1分子克隆接种30日龄健康广西巴马小型猪,利用实时荧光定量PCR技术对猪外周血单个核细胞抗病毒蛋白分子PKR、2'-5'OAS2、 RNase L和Mx1的mRNA转录水平的变化进行了定量分析。结果表明,PKR mRNA转录在接种后8 d和40 d呈上调趋势;而2'-5'OAS2 mRNA在3 d和17 d下调,Mx1 mRNA也在接种后17 d下调;RNaseL mRNA转录水平则没有发生明显变化。研究揭示P1感染猪后,机体的抗病毒蛋白的功能受到了不同程度的影响。     

肝片吸虫Fh8明显增强STEC的Stx1可溶性表达及Stx1单克隆抗体制备

志贺毒素1(Shiga toxin 1,Stx1),系五聚体蛋白,是产志贺毒素性大肠杆菌(Shiga Toxin-producing Escherichia coli,STEC)主要的毒素因子,但Stx1体外极不易可溶性表达,旨在克隆和表达志贺毒素1(Shiga toxin 1,Stx1)A亚基,体外获得可溶性表达的Stx1,以研制单克隆抗体。生物信息学软件分析Stx1A亚基氨基酸序列,Stx1A1亚基N端为信号肽段,其C端高疏水性和低免疫原性。PCR扩增stx1A亚基73~759的687个核苷酸,与肝片吸虫Fh8基因串联,克隆到低温表达载体p ColdⅠ以构建重组菌,诱导表达重组毒素His-Fh8-Stx1A,SDS-PAGE分析蛋白表达形式。重组毒素His-Fh8-Stx1A免疫Balb/c小鼠,Sp2/0细胞融合筛选、制备阳性杂交瘤和单克隆抗体。PCR扩增Fh8和stx1a亚基并构建重组质粒p ColdⅠ-His-Fh8-stx1,重组蛋白在原核细胞中得到高效表达,且以可溶性形式存在于菌体胞浆中。以重组His-Fh8-Stx1A为免疫原,成功制备3株能稳定传代并分泌Stx1的单克隆抗体(Mc Ab)的杂交瘤细胞株,取其中1株成功制备高ELISA效价的腹水。Western Blot显示,纯化的单克隆抗体可与重组免疫原His-Stx1A和天然志贺毒素1发生特异性反应。本试验成功可溶性表达志贺毒素1A亚基,并获得多株单克隆抗体,为研制用于检测STEC的夹心ELISA和胶体金试纸条奠定理论基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ基因的克隆、序列分析及表达

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型Ⅰ菌株序列设计了一对特异性引物，用PCR方法扩增毒素Ⅰ基因，得到约920bp的片段，与参考序列的核苷酸同源性达99．3％，定向克隆到pET32a（＋）中，转化BL21（DE3），经诱导后，毒素Ⅰ基因得到高效表达，Westemblot鉴定呈阳性。     

出血性大肠杆菌O157∶H7的Tir与Hly融合基因的构建和表达

构建表达Tir和Hly的融合基因,将Tir基因的C端414个氨基酸残基(Tir414)基因部分与Hly基因的C端300个氨基酸残基(Hly300)基因部分串联构建pET28a-Tir414-Hly300重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达.薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右.由于该融合蛋白由Tir和Hly2部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和溶血素(Hly)的抗体,在EHEC O157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值.     

产肠毒素性大肠杆菌肠毒素的研究概况

本文分析了大肠杆菌耐热肠毒素 (heat-stable,ST)和不耐热肠毒素 (heat- labile,LT)生物学特性、分子水平机制及其应用价值。一方面着重讲述 LT作为粘膜免疫佐剂的研究前景 ,利用体外定点突变方法构建不同的突变株并且均具有不同程度的佐剂活性 ,是霍乱毒素 (Choleratoxin,CT)很有希望的替代品。另一方面讲述ETEC基因工程亚单位疫苗的研究概况。ETEC只有 LT、ST两类肠毒素 ,通过不同方式构建融合基因探讨对 ETEC性腹泻防治效果。目前 ,这两方面均卓有成效 ,但还有许多的难点需进一步的研究     

H7-HCP-Tir-Intimin高效降低小鼠粪便中大肠杆菌O157:H7排菌

构建BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae),并评价对小鼠的免疫原性,以期研制更加有效的候选免疫原,最大限度降低E.coli O157:H7对食物、环境和人类的危害。将946、423、309、811bp的fliC,hcpA,tir和eae基因被依次克隆,中间添加8个氨基酸的间隔序列,构建重组菌BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae)。进口白油和ISA50V作为佐剂与重组蛋白乳化,制备2种油乳剂疫苗,分别接种4周龄BALB/c雄鼠,二免21d,口服攻击E.coli O157:H7109 CFU/只,每天采集粪便,检测排菌。结果显示,2种重组疫苗均能够诱导高滴度血清IgG。ISA50V佐剂组抗体产生早于进口白油佐剂组,但进口白油佐剂组抗体滴度一致性更好。所有免疫组小鼠排菌极度降低,第1天排菌低于104 CFU/g,第5天检测不到排菌,整个检测期无反弹,而对照组在整个检测期排菌持续很高(>104 CFU/g)。结果表明,四价重组蛋白H7-HCP-Tir-Intimin能够高效降低口服大肠杆菌O157:H7后的排菌,极显著降低细菌的定植,很大程度减少病原传播,对环境和人类的威胁。     

检测CSFV、JEV、PRRSV三种RNA病毒多重RT-PCR方法的建立

猪瘟病毒(CSFV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提。根据GenBank发表序列选取3对引物建立检测CSFV、JEV和PRRSV病毒的多重RT-PCR方法,扩增产物分别为508 bp、380 bp、263 bp。经与IDEXX商品化的检测CSW抗原试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;扩增JEV和PRRSV PCR产物分别经EcoR V和Sau3A I酶切得到预期的片段。建立的多重RT-PCR检测JEV、PRRSV和CSFV敏感度分别为12.5个TCID_(50)、10个TCID_(50)和10~(-3)ng总RNA。结果表明该多重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床三种病毒核酸的检测。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素单克隆抗体的制备及鉴定

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素的融合蛋白。用纯化的紧密素蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经4次有限稀释法克隆,成功获得2株能稳定传代并分泌抗紧密素单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。2株单抗分别制备腹水,ELISA检测效价分别为5.2×104,2.5×104。Western blot检测表明,2株单抗与融合蛋白发生特异性反应;ELISA检测表明,2株单抗可特异性检出大肠杆菌O157:H7。本研究为建立大肠杆菌O157检测方法提供了物质基础。     

仔猪水肿病的诊断

仔猪水肿病是由肠道溶血性大肠杆菌产生的毒素所引起的全身或局部麻痹、共济失调以及胃壁、结肠系膜、面部及全身水肿为特征的疾病，具有急性、散发性特点，主要发生于断奶后仔猪。 １．发病情况　肃宁县某个体经营的养猪场，每年出栏育肥猪２００头。仔猪均由集市分４批购进，每批５０头，均有发病，发病率达６０％，死亡率几乎１００％。发病猪均是身体强壮，采食快而多者，表现颜面水肿，有神经症状，后躯瘫痪后即死亡。经调查，该仔猪日粮中，玉米含量达８０％以上，且经常大量饲喂豆腐渣。发病后，使用青霉素、沙星类药物进行治疗，效…     

出血性大肠杆菌O157: H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶ H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势.构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右.重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA.二免后攻击50LD50的EHEC O157∶ H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短.结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHEC O157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值.