猪精子黏合分子1(SPAM1)基因新SNPs的鉴别及其在12个中外猪中的遗传变异研究

精子黏合分子1 (SPAM1)是一种在受精过程中起重要作用的精子抗原,以10 个中外猪种的20个无遗传相关公猪个体的基因组DNA为模板,扩增猪SPAM1基因的部分第二外显子和第三内含子2 个DNA片段,经PCR产物直接测序并作序列比较分析后在外显子2和内含子3上分别鉴别到1个新的单核苷酸多态(SNPs)位点,其中外显子2上的T>A碱基颠换(M191T-A)可导致其编码的苯丙氨酸突变为酪氨酸.SMART软件分析显示M191T-A处在SPAM1蛋白糖基水解酶保守域的编码区.建立PCR- TasI -RFLP方法检测了4个西方商业猪种以及8 个中国地方猪种791个个体在M191T-A位点的遗传变异情况,结果在八眉猪、莱芜黑猪、米林藏猪、杭猪、剑河白香猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪中检测到突变型等位基因A;而在二花脸猪、民猪、五指山猪和皮特兰猪中仅存在TT基因型,表现为极端的单态分布.     

应用牙釉蛋白(AML)基因鉴别牛早期胚胎性别

牛牙釉蛋白（AML）基因定位于牛X染色体和Y染色体上的同源区域.实验根据牛X、Y染色体AML基因第五内含子上序列同源性只有45.1%以及X、Y染色体该区段之间存在多处碱基缺失的特点,合成了1对性别特异性引物.该引物经扩增后母牛只得到1条467 bp的来自X染色体的扩增条带,而公牛能得到1条源自X染色体的467bp片段的扩增条带和1条源自Y染色体的341 bp的扩增条带.经基因组DNA验证,该引物的公母鉴定准确率为100%,同时该对引物具有高度的牛特异性.定量分析AML基因引物的反应灵敏度,发现1次PCR（30个循环）能扩增出0.5ng的基因组DNA,2次PCR（共50个循环）能扩增出20pg的基因组DNA.将AML基因引物与SRY基因引物的反应灵敏度相比较,结果表明前者的灵敏度比后者的高8～10倍.用AML基因反应体系鉴定了26枚优质胚胎,其中24枚有扩增结果,13枚鉴定为公牛,11枚鉴定为母牛.     

慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析

【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB（bone morphogenetic protein receptor, type IB）基因的猪胎儿成纤维细胞（pig fetal fibroblasts, PFF）,并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.mit.edu获得了21条sgRNAs（single-guide RNAs）序列;得分最高的sgRNA与互补序列（包含接头）退火成双链后连接入线性化的lentiCRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒psPAX2和pCMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45 μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺（polybrene）至终浓度为6 μg·mL^-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5 μg·mL^-1嘌呤霉素的培养液中筛选6-7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群。针对编辑（打靶）细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%（2/20）的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、CylinD2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降（P < 0.01）。Western blotting结果显示,打靶细胞BMPR-IB基因的表达量较对照组细胞降低62%。CCK-8检测试验表明,同一代细胞中,打靶PFF的增殖能力极显著低于对照组细胞（P < 0.01）;打靶细胞中,随着传代的（P5、P7和P9）增加其增殖能力极显著下降（P < 0.01）,而对照组细胞不同代次间细胞增殖能力无显著差异（P > 0.05）;打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在BMPR-IB基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用。     

猪腹股沟/阴囊疝易感位点定位及其候选基因研究进展

腹股沟/阴囊疝是猪最常见的遗传缺陷之一,每年给世界养猪业造成巨大的经济损失,其发病率一般在1.7%~6.7%,但在不同的品种和群体间有较大差异。已有研究表明,猪腹股沟/阴囊疝的发生主要受遗传因素影响,本文综述了猪腹股沟/阴囊疝疾病易感位点和相关侯选基因的研究进展,旨在为系统解析猪猪腹股沟/阴囊疝的分子遗传及病理机制提供参考,并对发展抗猪腹股沟/阴囊疝分子育种技术提出展望。     

利用南方地区本地黄牛移植冷冻奶牛胚胎的效果研究

共选用105头江西赣南地区地方黄牛作为受体,分3批次采用不同的发情处理方法及不同的饲养管理方法,分别在夏、秋、冬3个季节开展了一次冷冻胚胎移植工作,3次移植妊娠率分别为40%,36%,53.8%。结果表明:饲养管理及发情处理方法对移植妊娠率产生重要的影响,而黄体直径大小与移植妊娠率高低并不成正比关系,分析了在南方地区选用本地黄牛作为受体时影响胚胎移植妊娠率及移植效率的因素。     

二花脸FSH的高量表达对大白公猪睾丸的影响

促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)是一种动物垂体前叶嗜碱性细胞合成分泌的糖蛋白类促性腺激素.FSH在雄性动物体内的主要作用是刺激精子发生.本研究以15d和成年F1代转二花脸FSH公猪(Susscrofa)及其同日龄全/半同胞野生型公猪睾丸为材料,分析了其绝对重量和相对重量,制作了睾丸苏木精-伊红(HE)染色石蜡切片,统计了相关指标,通过qRT-PCR分析了生殖相关基因在睾丸中的表达量,与此同时,检测了睾丸中FSHβ和FSHR的甲基化率.睾丸绝对重量和睾丸脏体比分析结果表明,二花脸FSH的高量表达对大白公猪睾丸重量没有显著影响.睾丸HE染色石蜡切片分析结果显示,二花脸FSH的高量表达可以增加大白公猪睾丸中生殖母细胞的数量,对大白公猪睾丸组织结构无显著影响.qRT-PCR分析结果表明,二花脸FSH的高量表达没有影响内源生殖相关基因的表达.甲基化水平检测结果发现,二花脸FSH基因的高量表达对大白公猪睾丸中FSHβ和FSHR的甲基化水平没有显著影响.本研究结果表明,二花脸FSH的高量表达可以增加大白公猪睾丸中生殖母细胞的数量,从而提高大白公猪的生精能力,为研究精子发生过程提供参考依据.