牛源多杀性巴氏杆菌PlpE蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为体外表达牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)PlpE基因及制备抗PlpE蛋白多克隆抗体,根据PlpE基因核酸序列设计了1对特异性引物,通过PCR扩增PlpE基因,构建重组质粒pET-32a-PlpE;摇菌提取质粒,进行双酶切鉴定,鉴定正确后将重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG进行诱导,对诱导蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定;使用纯化蛋白PlpE免疫北京大耳白兔,制备多克隆抗体,并进行间接ELISA和Western Blot分析。结果显示,扩增的PlpE基因大小为1 050 bp,在原核细胞中诱导表达的PlpE蛋白约56 kDa。间接ELISA结果显示,所制备多克隆抗体效价可达1:512 000;Western Blot结果显示,所制备多克隆抗体反应性良好。PlpE蛋白的成功表达和多克隆抗体的成功制备,为下一步多杀性巴氏杆菌诊断方法的建立和疫苗研发奠定了基础。     

牛副流感3型病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛支原体多重PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感3型病毒(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛支原体(M.bovis)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的BPIV3的HN基因、IBRV的g C基因、BVDV的5'UTR和M.bovis的oppD/F基因序列设计特异性引物,通过优化反应条件建立了一种可以同时检测以上4种病原的多重PCR方法。结果显示,该方法对牛呼吸道合胞体病毒、小反刍兽疫病毒、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀巴氏杆菌A型和B型无特异性扩增,对BPIV3和BVDV的cDNA最低检测量分别为100 pg和1 ng,对IBRV和M.bovis的DNA最低检测量分别为10 pg和100 pg,具有较高的特异性和灵敏性。对临床33份鼻拭子样品和12份牛肺样品的检测结果与已发表文献中PCR方法的检测结果一致。本研究建立的多重PCR检测方法可同时对BPIV3、IBRV、BVDV和M.bovis进行检测,为这4种病原的诊断和检测提供了一种实用、便捷的方法。     

内蒙古地区部分奶牛场副结核病的血清学调查

采用ELISA检测方法对内蒙古地区17个奶牛场的2 391头奶牛进行牛副结核血清学检测。结果表明,大型奶牛场副结核的血清阳性率较低,在0~5%之间;小型奶牛场的副结核血清阳性率较高,平均阳性率为14.1%。调查结果提示,内蒙古地区奶牛场存在牛副结核病的流行,对该病的防控工作应给予高度重视。     

犊牛腹泻粪样中牛呼肠孤病毒的分离鉴定

通过在培养液中添加胰蛋白酶的方法,用MA104细胞从犊牛腹泻粪样中分离并鉴定了1株能稳定产生细胞病变(CPE)的牛呼肠孤病毒,命名为B-19株.RNA聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳可见呼肠孤病毒典型的10条核酸节段,呈3:3:4排列.电镜检测结果显示,病毒粒子呈典型呼肠孤病毒粒子形态,直径约70 nm;病毒L1基因保守区段RT-PCR检测及序列分析表明,扩增出的440 bp 目的片段符合预期大小,而且其核苷酸序列与GenBank参考毒株L1基因序列具有较高同源性;S1基因序列分析表明,B-19株属于呼肠孤病毒血清1型(ST1).     

我国部分地区犬布氏杆菌感染流行病学调查

为了了解我国部分省市犬感染布氏杆菌的情况。用血清样品用虎红平板凝集试验(RBT)和OIE标准间接酶标试验(i-ELISA)初筛,初筛阳性样品用试管凝集试验(SAT)复核,对SAT判定为阳性血清所对应的脾脏或新鲜全血进行布氏杆菌分离与培养。结果显示,4 750份犬血清中60份为阳性(29份检测到粗糙型布氏杆菌抗体:牧区2份、农区4份、城区23份;31份检测到光滑型布氏杆菌抗体:牧区19份、农区2份、城区10份),个体阳性率为1.26%(牧区6.69%,农区1.53%,城区0.84%);3份脾脏和1份新鲜全血经接种培养后,从1份全血中分离到1株菌,经AMOS-PCR方法鉴定为犬布氏杆菌。试验结果表明,调查的部分省市均有犬感染布氏杆菌,牧区个体阳性率最高、农区居中、城区最低,且存在粗糙型和光滑型布氏杆菌混合感染的现象。     

舍饲绒山羊布鲁氏菌病和蓝舌病血清流行病学调查

为了查明某绒山羊舍饲基地绒山羊流产、早产,羔羊死亡的病因.按国家布鲁氏菌病和蓝舌病检疫规程,采用血清凝集试验和琼脂扩散试验,对该绒山羊舍饲基地舍饲的绒山羊及其周边养殖户放养的绒山羊进行了布鲁氏菌病和蓝舌病血清流行病学调查.结果显示:舍饲绒山羊布鲁氏菌病和蓝舌病血清抗体阳性率分别为12.6%和21.9%;放养绒山羊布鲁氏菌病和蓝舌病血清抗体均为阴性.结果表明:该绒山羊舍饲基地舍饲的绒山羊中存在布鲁氏菌病和蓝舌病,应采取有效的综合防治措施加以控制.     

牛轮状病毒NSP5基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立检测牛轮状病毒(BRV)快速特异的荧光定量RT-PCR方法,本研究针对BRV NSP5基因设计了一对特异性引物经PCR扩增目的片段,并克隆于pCI载体作为重组质粒标准品(pCI-NSP5),经优化反应条件,建立了基于NSP5基因的BRV荧光定量RT-PCR方法,并对其进行了特异性、敏感性及重复性试验.结果显示,建...     

布鲁菌BAB基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

本研究以布鲁菌Rev.1株基因组为模板,扩增BAB基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,获得重组质粒pET-30a-BAB,对重组质粒进行原核表达,经Western blotting检测后,利用表达产物构建检测布鲁菌病的间接ELISA方法。结果表明,本试验成功克隆并表达了BAB基因,纯化表达产物经SDS-PAGE分析显示,本研究获得较纯的重组BAB蛋白;Western blotting试验表明,表达蛋白可与布鲁菌羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性;以重组BAB蛋白作为包被抗原,建立并优化了检测BAB抗体的间接ELISA方法。确定最佳包被条件：BAB蛋白包被量0.25 μg/mL,血清稀释度为1：400;封闭液为3%猪源明胶;二抗稀释度为1：6 000;显色时间为10 min。应用建立方法对临床40份羊血清进行检测,计算得出临界值为0.607。即当待检血清的P/N ≥ 1.5,且D_{450 nm} ≥ 0.607时,判定为阳性,当D_{450 nm} ≤ 0.561时,判定为阴性,当0.607 < D_{450 nm} < 0.561时,判定为疑似值,需要进行复检。与虎红平板试验和试管凝集试验比较,阳性符合率为100%,阴性符合率为71.88%,总符合率为77.5%。     

口蹄疫基因工程疫苗研究进展

口蹄疫是由口蹄疫病霉(Foot-and-Mouth Disease,Virus，FMDV)引起的偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，具有传染性强、传播速度快、传播途径广的特点，曾多次在世界发生大流行，被联合国粮农组织和世界动物卫生组织列为A类传染病之首。该病的爆发流行，给畜牧业生产和人民生活造成极大损失，严重影响国际贸易，为此，引起了世界各国的高度重视。