应用电镜技术诊断牛病毒性腹泻-粘膜病

呼和浩特市某奶牛场近年来不断发生犊牛腹泻.作者应用直接透射电镜配合免疫电镜技术对一腹泻致死犊牛的肠内容物进行了观察,发现有正六边形的病毒粒子,大小在60～70nm,外有囊膜包围,病毒粒子成堆出现。结合临床症状、病理变化、细菌学检查及电镜观察结果,诊断为牛病毒性腹泻-粘膜病.     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的扩增及酶切分析

以从内蒙古区分离的2株传染性喉气管炎病毒(ILTV)株的DNA为模板，用设计好的1对引物对这2株毒株的gB基因进行了PCR扩增，并对扩增产物分别用BglⅡ、PstⅠ、HindⅢ限制性内切酶酶切分析。结果表明，2个分离株均能特异性地扩增出该病毒gB基因片段，片段大小完全一致，为2．6kb；扩增产物的酶切图谱与参考株完全一致。     

产蛋下降综合征病毒DNA限制性酶切分析的研究

摘要：选用BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、HindⅢ等6种限制性内切酶对EDS两病毒内蒙古地区分离株(N3、B4)和参考株(AV-127)病毒基因组DNA进行酶切分析，均产生4，5，9，4，2和10条DNA片段，而且N3、B4株与参考株病毒基因组DNA之间的酶切图形、片段大小也十分相似，从分子水平上证实N3、B4株是EDS两病毒，同时也说明限制性内切酶分析法是检测EDS76病毒的一种简便快速的方法。     

溶血性曼氏杆菌PlpE基因原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立一种能够方便、高效检测溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)的方法,试验将溶血性曼氏杆菌重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,然后经IPTG诱导表达并纯化。以重组蛋白PlpE为包被抗原,通过优化抗原最佳包被浓度、一抗及二抗最佳稀释度、最佳反应时间和最佳显色时间等试验条件,建立了检测PlpE抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组质粒pET-32a-PlpE转化至感受态细胞BL21(DE3)后利用IPTG诱导,重组蛋白主要在沉淀中大量表达,经包涵体纯化试剂盒纯化后获得纯度较高的目的蛋白。重组蛋白PlpE具有良好的反应性,且蛋白大小符合预期。确定的检测条件为抗原包被浓度2μg/mL,一抗稀释度1∶300,酶标二抗稀释度1∶80 000,反应时间45 min,一抗反应时间30 min,显色时间15 min。用该方法检出溶血性曼氏杆菌阳性血清的最低效价可达1∶1 280,检测牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清、副结核分枝杆菌阳性血清、布鲁氏杆菌阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白（N）基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T．1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31（DE3）感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39．866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10％的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。     

鸡病毒性关节炎病毒C-98分离株S1基因的克隆与序列分析

提取鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）内蒙古分离株（C-98株）总RNA，参考GenBank中禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列设计了2对引物，应用RT—PCR技术扩增了病毒S1基因，将S1基因cDNA克隆到pGEM—T Easy载体后测序。将测定序列拼接后与参考毒株ARV-176、ARV-138、ARV-S1133、MDRV—YJL的S1基因序列进行了比较。结果显示，AVAV C-98分离株的S1基因与强毒株ARV-176株的同源性最高，达99．9％；与MDRV—YJL的同源性为99．3％，与弱毒疫苗株ARV—S1133的同源性也达97．9％；与ARV-138株的同源性最低，为81．2％。表明，AVAVC-98株与参考毒株的差异较小，与疫苗株ARV-S1133有很高的同源性。     

AMOS PCR在布鲁氏菌种型鉴定中应用的研究

AMOSPCR是近年来在布鲁氏菌上尝试使用的一种布鲁氏菌检测方法,可作为布鲁氏菌诊断及菌种类型鉴定的PCR方法,可区分牛种布鲁氏菌1、2、4型,羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌。本试验用来自国内的疫苗S2,M5及国际上常用的布鲁氏菌疫苗S19,104M试验AMOSPCR的效果,同时对AMOSPCR扩增条带进行测序。结果表明,除国内布鲁氏菌S19检测结果与国外菌株不同外,其余的几种疫苗株都得到典型的特征性条带。同时测序结果也表明各种属条带无交叉反应,为今后国内诊断布鲁氏菌病诊断方法研究指出一个方向。     

牛细小病毒病毒样颗粒的组装及其免疫原性评价

为研究牛细小病毒(BPV)VP2衣壳蛋白自组装病毒样颗粒(VLPs)以及VLPs的免疫原性.本研究以BPV-1型C7-5中国分离株的基因组序列为模板扩增VP2蛋白的编码基因,将其克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coliB J5183内同源重组将VP2基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带BPVVP2基因的重组腺病毒质粒(pAd-BPV-VP2).该重组质粒经Pac Ⅰ线性化后转染Ad293细胞,获得重组腺病毒rAd-BPV-VP2,第8代时滴度为107.25 TCID50/mL.间接免疫荧光、westemblot以及电镜观察结果显示,BPV VP2蛋白可以在腺病毒系统中稳定表达,并有效组装VLPs.将rAd-BPV-VP2肌肉注射免疫BALB/c小鼠,结果显示,针对BPV的血清IgG和中和(VN)抗体分别于加强免疫后2周和8周达最高水平,高峰抗体可持续至15周,VN抗体的最高滴度可达1:4 000.此外,与对照小鼠血清相比,免疫小鼠血清中的IL-2、IL-4及IFN-γ含量显著升高(p＜0.05).结果表明,rAd-BPV-VP2免疫小鼠后可以诱导机体产生针对BPV的特异性体液和细胞免疫.本研究为BPV的免疫预防及载体的开发奠定了基础.     

载牛冠状病毒N蛋白壳聚糖微球的免疫效果评价

为了对壳聚糖分子作为佐剂的缓释效果进行免疫学评价,本研究合成了牛冠状病毒DB2毒株N蛋白基因的3'端第487位～1287位碱基,用大肠杆菌对其进行了高效表达,通过SDS-PAGE电泳分离、电洗脱纯化该牛冠状病毒N蛋白(BCV N).以戊二醛为交联剂,采用乳化交联的方法制备空白壳聚糖微球.利用吸附法制备载BCVN蛋白的壳聚糖微球,通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测免疫鼠血清中的抗体水平,由此评价壳聚糖微球对BCVN的缓释作用和佐剂效应.结果表明,壳聚糖微球的形态较好、表面光滑、分散性较好,平均粒径为6.50±1.77μm,电势分布在36 mV,吸附BCV N蛋白的壳聚糖微球在体内所产生的免疫效果明显优于唯N蛋白组,说明载BCV N蛋白的壳聚糖微球在体内具有一定的缓释效果,使N蛋白在体内缓慢释放而长时间诱导抗体的产生,该研究结果为以壳聚糖微球作为疫苗佐剂积累了实验数据.