检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9亚型禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)为抗原包被ELISA板,通过反应条件的筛选,建立检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA(NP-ELISA)方法。结果表明,抗原最佳包被质量浓度为7.56μg/ml,血清最适稀释度为1∶160,作用时间为60 min;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG最适稀释度为1∶5 000,血清和酶标抗体最适作用时间为60 min。特异性试验结果表明,NP抗原可与H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体发生反应,经NP-ELISA检测为阳性的H9亚型AI血清样品能够被H9亚型AIV阻断,而NP抗原与新城疫等4种疫病阳性血清不发生反应。对223份待检鸡血清进行检测,NP-ELISA阳性检出率为96.86%(216/223),而血凝抑制试验、琼脂免疫扩散试验结果分别为93.72%(209/223)和81.61%(182/223),表明NP-ELISA是检测禽流感型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。     

山药多糖对PRRSV灭活苗免疫猪抗体和T细胞亚群的影响

研究山药多糖对PRRSV灭活苗免疫抗体和猪外周血T细胞亚群的影响。选择35日龄断奶仔猪16只,随机分为4组,将山药多糖分别以17.1mg/kg和8.55mg/kg两个剂量和猪PRRSV灭活苗同时注射,于免疫后7,14,24,34,44,54,69,79d采血,ELISA方法检测猪PRRSV抗体水平,流式细胞术检测猪外周血中T淋巴细胞亚群的变化。结果表明,山药多糖可显著提高PRRSV灭活苗免疫猪外周血CD3+和CD8+细胞数量,在免疫34d后,两个剂量的山药多糖均可显著提高PRRSV灭活苗免疫抗体水平。山药多糖可以作为免疫增强剂与PRRSV灭活苗联合使用。     

河南地区猪圆环病毒2型感染的血清流行病学调查

为初步了解河南地区猪群中猪圆环病毒2型(PCV2)的感染情况,应用ELISA方法对河南12个地区的226份血样进行PCV2抗体检测,结果抗体阳性率为53.10%。其中母猪抗体阳性率为70.37%,公猪抗体阳性率为40.00%,育肥猪抗体阳性率为50.00%,仔猪抗体阳性率为46.67%。并对猪圆环病毒2型与其他病原混合感染情况做了调查,结果表明:与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)混合感染的比例为26.67%;与猪瘟病毒(CSFV)混合感染的比例为35.83%;与猪伪狂犬病毒(PRV)混合感染的比例为16.67%;与猪传染性胸膜肺炎(APP)混合感染的比例为61.67%。调查分析初步表明:PCV2感染在河南地区普遍存在,并极易与其他病原混合感染。     

蜂素信号肽介导猪干扰素-γ在杆状病毒中分泌表达及抗病毒活性检测

应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟的猪干扰素-γ基因插入供体质粒pFastBacTM1polyhedrin启动子控制下的多克隆位点,引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(Honeybee melittin signal peptide)取代猪干扰素-γ原有信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组蛋白通过SDS-PAGE、间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性是1.38×106U/mL。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的遗传变异分析

用间接免疫荧光试验和RT-PCR方法,从河南省不同地区送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料中分离到16株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),扩增分离株的ORF5基因并进行序列测定、比较分析和绘制进化树.结果表明,16株分离株之间的氨基酸序列同源性为88.1%～99.8%;与欧洲型LV株和美洲型VR-2332株的氨基酸序列同源性分别为54.0%～54.5%和88.1%～99.2%,证明分离的16株病毒均为美洲型.用DNAstar等软件对16株分离株推导的氨基酸序列作进一步比较分析,发现16株分离株ORF5基因编码的gp5蛋白的抗原区、潜在疏水区、跨膜区和N-糖基化位点分布均有差异,与其它美洲型毒株也存在一定程度的差异,说明在河南流行的PRRSV存在明显的遗传差异性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP4蛋白免疫活性研究

克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的ORF4基因,将疏水序列缺失后,再克隆到原核表达载体pET-32a中,得到阳性重组质粒,经IPTG诱导,纯化后由Western blotting分析,并将所得的包涵体、变性蛋白和复性蛋白分别免疫小鼠,获取的血清抗体进行效价和中和活性的检测。为深入研究GP4蛋白的免疫特征奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒及猪细小病毒复合PCR检测方法的建立

根据Genbank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因和猪细小病毒(PPV)的VP2基因的保守序列,设计合成了2对特异引物,分别建立了PRV和PPV的单项PCR诊断方法,通过优化PCR条件最终成功地建立了PRV和PPV的复合PCR诊断方法.敏感性检测结果表明,对PRV的检测可以达到10-10.5/100 μL TCID50、对PPV的检测可以达到109.5/100 μL TCID50.对20头份病、死猪的血清、淋巴结、肺、肝等组织进行检测,结果5头份PRV阳性,3头份PPV阳性,其中3头份PRV和PPv同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性.结果表明,PRV和PPV复合PCR诊断方法具有高度特异性和敏感性,可用于兽医临床诊断.     

猪源肠球菌两种致病基因和表型的检测

摘要：目的：调查53株猪源肠球菌2种致病基因和2种表型的分布。方法：应用聚合酶链反应检测53株肠球菌的2种致病基因,用50mL/L兔血平板和30g/L明胶平板检测β溶血和明胶溶解表型。结果：粪肠球菌、屎肠球菌和鸟肠球菌2种致病基因的检出率分别为cylA 94.4%、96.9%、100%; gelE 100%、87.8%、50%;β溶血检出率分别为72.2%、42.4%、0;明胶溶解检出率分别为100%、0、0。结论：细胞溶解素激活基因(cylA)明胶酶基因(gelE)为猪源肠球菌的主要致病基因;粪肠球菌2种致病基因和2种表型的检出率高于屎肠球菌;来源于新鲜猪肉中的粪肠球菌存在较强的毒力,提示注意食品卫生安全;在新鲜猪肉中检测到2株鸟肠球菌,基因型和表型检测说明其存在较弱毒力。     

利用荧光定量PCR方法研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞的增殖规律

摘要:猪繁殖与呼吸综合征病毒可以在原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)、CL2621细胞系及Marc-145细胞系上生长繁殖,但对于其增殖规律不甚了解。试验利用实时荧光定量PCR技术,研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖规律;结果发现:病毒在接种后12 h开始大量增殖,在18-36 h增殖最为迅速,在36-48 h病毒增殖达到最高峰;研究还发现在18 h 时Marc-145细胞开始释放病毒,48 h达最高峰。该结果为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机理及利用细胞毒生产疫苗提供试验基础。     

禽大肠杆菌和葡萄球菌混合感染的诊断与治疗

河南某鸡场购入一批20日龄的雏鸡,第2天个别雏鸡出现精神萎顿、食欲不振、羽毛蓬松甚至脱落、关节肿胀、缩头闭眼、拉稀粪、呼吸困难等症状。对同期购进鸡苗的2个分场的养殖情况和养殖条件进行比较,根据其发病情况、临床症状、剖检变化、实验室诊断和动物试验,确诊为禽的大肠杆菌和葡萄球菌的混合感染。经采取相应治疗措施,取得了良好的效果。