莪术油注射液的制备及体外抗PRRSV作用试验

为筛选抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的中药,制备了莪术油注射液,并以其为试验药物,同时以利巴韦林注射液作为对照药物,观察在体外细胞上对PRRSV的作用效果。结果表明,自最大安全浓度(质量浓度)作倍比稀释后,二者对PRRSV均具有一定的抑制、杀灭和阻断作用。其中,莪术油注射液对PRRSV的杀灭作用较为突出,利巴韦林注射液杀灭和抑制作用均较为显著。     

蜂素信号肽介导猪干扰素-γ在杆状病毒中分泌表达及抗病毒活性检测

应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟的猪干扰素-γ基因插入供体质粒pFastBacTM1polyhedrin启动子控制下的多克隆位点,引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(Honeybee melittin signal peptide)取代猪干扰素-γ原有信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组蛋白通过SDS-PAGE、间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性是1.38×106U/mL。     

检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9亚型禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)为抗原包被ELISA板,通过反应条件的筛选,建立检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA(NP-ELISA)方法。结果表明,抗原最佳包被质量浓度为7.56μg/ml,血清最适稀释度为1∶160,作用时间为60 min;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG最适稀释度为1∶5 000,血清和酶标抗体最适作用时间为60 min。特异性试验结果表明,NP抗原可与H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体发生反应,经NP-ELISA检测为阳性的H9亚型AI血清样品能够被H9亚型AIV阻断,而NP抗原与新城疫等4种疫病阳性血清不发生反应。对223份待检鸡血清进行检测,NP-ELISA阳性检出率为96.86%(216/223),而血凝抑制试验、琼脂免疫扩散试验结果分别为93.72%(209/223)和81.61%(182/223),表明NP-ELISA是检测禽流感型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的遗传变异分析

用间接免疫荧光试验和RT-PCR方法,从河南省不同地区送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料中分离到16株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),扩增分离株的ORF5基因并进行序列测定、比较分析和绘制进化树.结果表明,16株分离株之间的氨基酸序列同源性为88.1%～99.8%;与欧洲型LV株和美洲型VR-2332株的氨基酸序列同源性分别为54.0%～54.5%和88.1%～99.2%,证明分离的16株病毒均为美洲型.用DNAstar等软件对16株分离株推导的氨基酸序列作进一步比较分析,发现16株分离株ORF5基因编码的gp5蛋白的抗原区、潜在疏水区、跨膜区和N-糖基化位点分布均有差异,与其它美洲型毒株也存在一定程度的差异,说明在河南流行的PRRSV存在明显的遗传差异性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP4蛋白免疫活性研究

克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的ORF4基因,将疏水序列缺失后,再克隆到原核表达载体pET-32a中,得到阳性重组质粒,经IPTG诱导,纯化后由Western blotting分析,并将所得的包涵体、变性蛋白和复性蛋白分别免疫小鼠,获取的血清抗体进行效价和中和活性的检测。为深入研究GP4蛋白的免疫特征奠定了基础。     

猪圆环病毒PCR检测方法的建立

本研究建立了检测猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究.该方法具有快速、敏感、特异性强等特点,从PCV2感染的细胞中町最低扩增到0.1 ng的DNA,且对其它病原微生物如PRV、PPV不能检出.可对病料、血清提取DNA进行检测,所有程序在5 h内得出结果.该方法可用于PCV2感染猪的快速诊断,引种检疫,分子流行病学调查.     

猪细小病毒不同代次VP2基因序列差异分析

将猪细小病毒NJ-1株在PK-15细胞上传代到35代,利用PCR及序列测定对01代、07代、14代、21代、28代及35代的VP2序列进行了测定,并推导出相应的氨基酸序列;通过对不同代次的毒株核苷酸及氨基酸序列之间的差异性进行了分析。结果表明,不同代次之间具有高度的同源性,其中核苷酸及氨基酸序列同源性分别为99.7%-100.0%、99.2%-100.0%,核苷酸的差异呈现有一定的规律性,随着代次之间的间隔增大其差异也相应增加,但氨基酸序列差异不明显,猪细小病毒核酸呈现较强遗传稳定性。     

山药多糖对PRRSV灭活苗免疫猪抗体和T细胞亚群的影响

研究山药多糖对PRRSV灭活苗免疫抗体和猪外周血T细胞亚群的影响。选择35日龄断奶仔猪16只,随机分为4组,将山药多糖分别以17.1mg/kg和8.55mg/kg两个剂量和猪PRRSV灭活苗同时注射,于免疫后7,14,24,34,44,54,69,79d采血,ELISA方法检测猪PRRSV抗体水平,流式细胞术检测猪外周血中T淋巴细胞亚群的变化。结果表明,山药多糖可显著提高PRRSV灭活苗免疫猪外周血CD3+和CD8+细胞数量,在免疫34d后,两个剂量的山药多糖均可显著提高PRRSV灭活苗免疫抗体水平。山药多糖可以作为免疫增强剂与PRRSV灭活苗联合使用。     

河南部分地区H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及交叉免疫攻毒保护试验

为了分离鉴定河南漯河、郑州H9亚型禽流感病毒及交叉免疫攻毒保护试验。于2011年用SPF鸡胚从河南漯河、郑州疑似感染H9亚型禽流感病毒的病料中分离出2株病毒,通过血凝及血凝抑制试验和RT-PCR方法进行鉴定,确定为AIV H9亚型;用河南省动物性食品安全重点实验室于2001年分离的2株H9亚型禽流感病毒分别制成油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,然后再用上述4株病毒对免疫鸡群进行交叉攻毒,进行交叉免疫保护试验,测定其交叉免疫保护作用。结果表明：成功分离出2株H9亚型禽流感病毒;用2001年分离毒株所制备出的灭活疫苗免疫鸡后,试验鸡体内抗H9亚型禽流感HI抗体效价均明显上升,平均HI效价均大于11log2,不同毒株所诱导产生的HI抗体效价存在一定的差异;不同时期及地点分离的H9亚型禽流感流行毒株间均产生了较好的交叉保护,且同一地区的保护率更高,2001年的分离株对目前的流行毒株仍有很好的保护作用。     

HLA-A胞外区成熟肽基因的克隆及其原核表达载体的构建

根据GenBank基因库中HLA-A胞外区成熟肽基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从健康人血液中扩增HLA-A胞外区基因,扩增产物进行T-A克隆、测序.结果表明,获得的HLA-A胞外区基因大小为819 bp,与模板序列的同源性为96%.利用基因重组技术,将HLA-A胞外区基因亚克隆入pET-21a(+) 载体中.经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET-21/ HLA-A中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET-21/ HLA-A.