鸡传染性喉气管炎病毒河南株gB基因真核表达载体的构建及表达

根据已发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列,设计并合成1对引物,以河南分离株(ILTV-HN)接种10日龄鸡胚,从含痘斑的绒毛尿囊膜中提取基因组DNA扩增gB基因,将扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序,结果表明克隆到ILTV-HN株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框.然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-gB,转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过RT-PCR检测,转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测,结果表明gB基因在CEF细胞中进行了瞬时表达.     

NDVF基因真核表达质粒的构建及其与鸡IL-18基因联合免疫的初步研究*

 为了探索鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白的免疫原性及鸡白细胞介素-18(IL-18)的免疫增强作用,通过PCR和酶切方法将NDV F基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA-F。用质粒pcDNA-F单独或与鸡IL-18重组真核表达质粒pIL-18联合免疫14日龄SPF鸡。首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第14 d用NDV强毒F48E9株进行攻击。结果表明,质粒pcDNA-F与pIL-18联合免疫显著提高鸡体的细胞免疫水平,并且提供了50%免疫保护,这为ND的防治开辟了新的途径。     

7种中草药提取物对猪链球菌的体外抑菌试验

为了观察中草药对猪链球菌的体外抑菌效果,将所选中草药按常规法制备水提取物、醇提取物,用试管2倍稀释法检测中草药水提物、醇提物对猪链球菌的体外抑菌作用。结果表明,所选7种中草药对猪链球菌均具有一定的抑菌作用,其中黄连醇提物的抗菌活性最强,仙鹤草、地锦草醇提物抗菌活性较强,板蓝根、马齿苋醇提物抗菌活性较弱。     

伪狂犬病病毒Min-A株TK基因的克隆与序列分析

参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒TK基因的序列设计了1对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体．对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性．测序结果表明目的片段包含1个957bp的开放性阅读框(ORF),编码318个氨基酸组成的多肽．在TK ORF上游-22,-166,-199位存在3个GC框样序列,在终止密码子下游第110个核苷酸处的l306位存在有多聚腺苷加尾信号．PRV Min-A株与PRV Ea株、NIA-3株TK的核苷酸同源性分别为98．4％,97．9％;推导氨基酸的同源性分别为97．8％,97.2％．通过对α疱疹病毒TK氨基酸进行多序列比较．获得了在PRV TK氨基酸序列上的6个保守区间．推测这些保守氨基酸对于胸苷激酶(TK)结构的稳定性和催化活性的发挥是必需的。     

4种中药多糖对猪脾淋巴细胞增殖的影响

为筛选免疫活性较好的中药多糖和研制新型猪用免疫增强剂,用MTT比色法比较了不同浓度的板蓝根多糖(IRPS)、牛膝多糖(ABPS)、山药多糖(CYPS)和黄芪多糖(APS)等4种中药多糖对猪脾脏淋巴细胞增殖的影响。结果表明,IRPS,ABPS,CYPS,APS均能显著刺激ConA或LPS诱导的猪脾淋巴细胞增殖(P<0.05),且4种多糖促进猪脾淋巴细胞增殖的作用与多糖浓度有关。     

固始鸭白细胞介素2基因的克隆及分子进化分析

根据已发表的鸭白细胞介素（IL-2）cDNA序列设计并合成1对引物,直接从成年固始鸭脾淋巴细胞中提取的总RNA,应用反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增鸭儿-2cDNA,将扩增片段克隆入pGEM—TEasy载体,并对其进行测序、结果表明,扩增片段长度为446bp,与预期大小一致,为鸭,IL-2基因的编码区全长,共编码140个氨基酸的多肽、把该基因编码的鸭IL-2氨基酸序列与已公布的禽及哺乳动物IL-2氨基酸序列进行比较,其同源性分别在54．3％～100％和15．0％～17．9％之间．分子系统进化树分析表明,固始鸭,IL-2与哺乳动物,IL-2有共同的祖先,亲源关系较近,但在免疫系统选择性压力下,形成独特的种族特异性．     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP5基因的克隆及在293T细胞中表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCC VR-2332株GP5基因序列设计1对特异性引物,应用RT—PCR方法扩增PRRSVHn／06-1分离株GP5基因片段．将扩增片段克隆到真核表达载体pcDNA3．0中,测序后用DNAstar序列分析,构建的pcDNA—GP5重组质粒瞬时转染293T细胞,48h后用Western-blot检测。证明GP5基因在293T细胞中获得了表达,可与PRRSV阳性血清发生特异性反应．     

应用16S rRNA基因序列分析鉴定猪源肠球菌

对河南省不同地区病猪分离的11株疑似肠球菌提取基因组DNA,PCR扩增16SrRNA基因片段,经克隆后测序,并与GenBank中注册的相关肠球菌菌株的16SrRNA基因序列进行比较、绘制系统发育树,进行鉴定。结果表明,4株临床分离株鉴定为粪肠球菌（E.faecalis）,7株为屎肠球菌（E.faecium）。首次从分子水平上证实了猪肠球菌在河南省的存在,为临床诊断及分子鉴定提供依据。     

免疫复合物对猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导的PAM细胞因子转录的影响

本试验通过研究免疫复合物影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在巨噬细胞内增殖的因素,来进一步探讨免疫复合物经FcγR介导的PRRSV感染机制.本研究将含200 TCID50 PRRSV病毒液与等体积的终浓度为1.30 mg· mL-1的猪IgG-兔抗猪IgG复合物分别先后和同时接种于PAM细胞,分别于12、24、36、48 h收集细胞液,同时设PRRSV感染对照组、免疫复合物对照组和健康细胞对照组,利用建立的相对荧光定量PCR和绝对荧光定量PCR方法分别检测巨噬细胞中IFN-α、IL-10和TNF-α的mRNA转录水平及PRRSV的RNA水平,并进行定量分析,同时采用ELISA方法检测健康细胞中IFN-α的蛋白水平.结果显示,在感染后12～36 h期间,免疫复合物能够抑制PRRSV诱导的IFN-α的mRNA水平,TNF-α mRNA水平在感染后12 h被促进,而在24～36 h期间被抑制.在感染后48 h,免疫复合物能促进IFN-α和TNF-α的mRNA水平,而在12～48 h期间均能抑制IL-10的mRNA水平,此外,免疫复合物在感染12、24和36 h时间段内均能明显促进病毒的增殖,但在48 h后不显著.健康细胞中IFN-α的蛋白水平在培养12～48 h之内呈“降-升-降”的趋势.结果表明,IFN-α蛋白的表达与其mRNA的转录不同步.在PRRSV感染初期,免疫复合物能抑制PRRSV诱导的抗病毒因子的mRNA水平,病毒的复制被促进,而在感染后期,抗病毒因子达到一定的浓度后发挥抗病毒作用,在一定程度上抑制病毒的复制.而TNF-α的转录规律不明显,表明免疫复合物可能同时与激活型和抑制型FcγR结合来共同调节PRRSV诱导的细胞因子的转录.     

猪Fc受体γ亚单位基因克隆与原核表达

应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。成功克隆出猪Fc受体γ亚单位基因并表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。