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71.
【目的】在毕赤酵母中构建禽腺病毒(FAdV)血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白表达系统,并探索适宜的表达条件。【方法】以前期构建的重组质粒pCold-Fiber2-Fiber为模板,用PCR法扩增Fiber2-Fiber片段,连接pPICZαA载体。经双酶切和测序鉴定后的阳性重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber电转化毕赤酵母GS115。经MD平板和不同浓度Zeocin抗性筛选后进行PCR扩增和测序鉴定得到阳性菌株;用甲醇诱导表达阳性菌株,72 h后收集蛋白上清进行SDS-PAGE和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定。采用单因素变量法对不同pH(5.0、6.0、7.0和8.0)、甲醇浓度(0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)、时间(24、48、72和96 h)进行表达条件优化,用SDS-PAGE鉴定,并用间接ELISA和Western blotting验证重组蛋白的反应原性。【结果】成功构建了重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber,对表达72 h后的上清进行SDS-PAGE发现1条约70 ku的特异条带,经LC-MS/MS鉴定为目的蛋白。... 相似文献
72.
为了诊断青岛博隆实验动物养殖基地比格犬病死原因并制定有效防控措施,试验通过临床观察和病理解剖对病犬进行初步诊断;无菌采集病死幼犬肺组织,采用特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)诊断三种常见犬呼吸道病毒,通过细菌形态学观察、生化试验、基因测序鉴定分离病原菌,并通过小鼠致病性试验和药敏试验分析其致病性和优化用药方案。结果表明:犬发病时主要表现为咳嗽、流鼻涕、食欲不振和轻度腹泻等症状。剖检可见胸腔积液,肺叶淤血和坏死。PCR鉴定犬腺病毒2型(canineadenovirus type 2, CAV 2)、H3N2亚型犬流感病毒(H3N2 subtype canine influenza virus, CIV)和犬副流感病毒(canine parainfluenza virus, CPIV)均为阴性。细菌分离培养显示为该菌革兰氏阴性的粗短杆菌;生化试验和16S rDNA测序鉴定该菌为肺炎克雷伯菌。回归试验结果表明该菌可引起小鼠肺炎症状,具有较强致病力。药敏试验结果显示分离菌株对阿奇霉素、环丙沙星、恩诺沙星敏感,对氨苄西林、头孢他啶、庆大霉素、头孢... 相似文献
73.
鸡新城疫病毒荧光双链引物实时荧光PCR检测方法的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
根据鸡新城疫F糖蛋白的保守基因序列,设计一对正引物。根据正引物设计一对与之相互补的负引物。正引物的5’端标记FAM,负引物的3’标记淬灭剂DABCYL。反应体系中进行引物杂交后,由于正、负引物完全互补,FAM产生的荧光被标记在负引物上的DAB—CYL淬灭掉。然后利用杂交后生成的荧光双引物对鸡新城疫及AIV、ILTV、IBV四种病毒争MG进行了实时荧光PCR检测。结果表明,只有以鸡新城疫标准毒株的克隆质粒为模板的管中能够检测到荧光信号,其他管中没有信号产生。该方法特异性强,灵敏度高,重复性好,在鸡新城疫临床诊断和出入境检疫中有着广阔的应用前景。 相似文献
74.
实验采用6只绵羊分成3组,一组作为对照接种BHK21细胞上清液,另二组分别接种BIV10和中国分离株Z1株,攻毒定期采血提取抗原并提取病毒RNA,同时进行琼脂扩散试验、普通PCR、Nested-PCR试验。结果在整个攻毒期间,琼脂扩散方法检测不到抗原,普通PCR方法只能在攻毒后12d-15d测得抗原,而Nested-PCR在攻毒后6d即可测得病毒RNA,并且可一直持续到30d。试验证明,Nested-PCR方法是高度敏感的检测抗原的方法。在临床上能够较早地检出抗原,这对于及时采取有效措施,控制疾病流行具有积极的意义。 相似文献
75.
76.
77.
针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因设计了2对特异性引物,建立了快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,并进行了酶切鉴定以及特异性、灵敏性和临床试验确定。酶切鉴定试验结果与RT-LAMP结果完全符合;特异性试验结果表明本研究所建立的RT-LAMP检测方法只针对猪繁殖与呼吸综合征病毒;灵敏度试验结果显示RT-LAMP是RT-PCR方法的100倍;临床试验中RT-LAMP方法的检出率与病毒分离的符合率为100%。本检测方法操作简单,不需要复杂的仪器,是适合基层和现场检测而无需送至诊断实验室的快速灵敏实用的分子生物学检测方法。 相似文献
78.
旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的多重PCR检测方法。参考相关文献及序列比对结果设计6对特异性引物,建立了可同时检测以上6种病毒的多重PCR方法并应用此方法对临床病例进行了检测。结果表明,所建立的多重PCR方法灵敏度高,对6种病毒的最低核酸检测量分别为12.8pg(PRRSV)、46pg(CSFV)、16pg(PRV)、23.5pg(PCV-2)、72pg(PPV)、8.6pg(PCMV),对猪流感病毒(SIV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)无特异性扩增。应用该方法对临床145份样品进行检测,总阳性率为83.45%,2种以上病毒混合感染阳性率为69.66%。说明所建立的多重PCR检测方法敏感,可用于猪群中上述6种猪病病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。 相似文献
79.
1974年,Tischer[32]发现,在多株连续传代的PK-15细胞中存在一种形态类似小RNA病毒的圆型小颗粒病毒,该病毒可以持续感染PK-15细胞,不会引起细胞病变。Tischer[33]证实,PK-15细胞中存在的这种病毒来源于当初制备PK-15细胞的猪肾组织,病毒的基因组由一个单股呈圆环状的DNA链组成,是一种新发现的病毒,称为猪圆环病毒(PCV)。血清学调查表明,PCV在柏林附近猪群中的阳性感染率高达77%-95%[34],之后加拿大[11]、新西兰[18]、英国[12]、北爱尔兰[1… 相似文献
80.