犬常见传染病诊断基因芯片的研究与应用

根据PCR技术扩增出犬腺病毒（CAV）ORF1（p-Ⅷ）基因、犬细小病毒（CPV）VP2基因、鸡血红蛋白的珠蛋白基因（GLOBc）各保守基因片段；采用RT—PCR扩增出犬冠状病毒（CCV）纤突蛋白（S）基因、犬瘟热病毒（cDV）融合蛋白（F）基因、犬副流感病毒（CPIV）核衣壳结构蛋白（NP）基因、狂犬病病毒（RV）核蛋白（N）基因的各一段保守序列，克隆荻取质粒。通过微量点样技术将这些质粒作为探针点在硝酸纤维素膜上，产生二维DNA探针阵列，制作成诊断基因芯片。对360份待检样品匀浆后提取核酸作为模板，扩增相应保守基因片段。通过生物素标记PCR（RT—PCR）技术，将所获得的扩增产物与诊断基因芯片进行特异性的逆向点杂交，然后用扫描仪对芯片进行扫描分析、判断。结果表明，此方法比病毒分离、HI、PCR或RT—PCR方法灵敏度高、特异性强，平均检出率要高20％以上，并可同时对犬多种疫病进行快速诊断。     

犬细小病毒CPV-QD12株的分离鉴定与序列分析

本试验成功分离了1株犬细小病毒,采用PCR、理化特性检验、HA及HI等方法对其进行了鉴定,并对其编码区全基因序列进行了分析。取临床患出血性肠炎幼犬粪便经无菌处理后同步接种F81猫肾细胞分离病毒,盲传至第4代开始出现典型的细胞病变。该病毒可凝集猪的红细胞,血凝效价为28,可被犬细小病毒单克隆抗体特异性中和而产生血凝抑制现象;病毒效价为105.5TCID50/m L;毒株对氯仿和胰酶不敏感,且耐酸耐热。经病毒理化特性试验及犬细小病毒单克隆抗体的血凝抑制鉴定其为犬细小病毒,通过PCR检测及编码区全基因的扩增、测序和序列比较,证实所分离毒株为CPV-2a亚型,并将其命名为CPV-QD12株,与2013年分离自中国江苏省的CPV-2a型犬细小毒株CPV-JS2及2011年分离自中国广西的CPV-2a型毒株CPV-JQ686671.1的编码区核苷酸相似性为99.6%,具有较近的亲缘关系。该研究可为诊断和防控犬细小病毒病提供参考。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法检测猪流感H3N2亚型病毒方法的建立

本试验针对H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因建立SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR检测方法.根据GenBank上的SIV N2基因序列设计一对引物,扩增片段406bp.纯化扩增目的片段后连接pMD18 T载体中,命名为pMD18-TN2,转化入E.coli DH5α,测序正确作为阳性模板,优化反应条件建立方法.此荧光PCR方法所能检测最低病毒含量为75 copies/μL,拥有良好的特异性和重复性.此方法的建立将为流感病毒N2亚型神经氨酸酶基因定型检测提供一种有效方法.     

我国H9N2亚型禽流感流行现状分析

自从1994年在我国首次分离到 H9N2亚型禽流感病毒以来,该病已经在我国广泛流行,可以说我国凡是有鸡的地方,就有 H 9N 2亚型禽流感流行。除此之外,又有不断从猪、鸵鸟、鸭、鹅等动物分离到H 9N 2病毒的报道。     

63株H9N2亚型禽流感病毒NA基因序列分析

为了从分子水平上掌握我国H9N2亚型禽流感病毒NA基因变异情况和流行规律,作者汇集了我国部分省市的63株H9N2亚型禽流感毒株,采用RT-PCR技术对其NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得序列进行同源性和进化分析。结果显示分离株核苷酸同源性在87.4%~99.5%;52株NA蛋白颈部63—65位点缺失了T、E、I 3个氨基酸,属于Y280-like分支,11株没有发生缺失,属于G9-like分支,没有发现G1-like分支和Y439-like分支的NA基因毒株;唾液酸结合位点(HB)和抗原决定簇的氨基酸发生了明显的变异;酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂奥塞米韦和扎那米韦相关的氨基酸突变;36/63毒株失去了402位点处的潜在N-糖基化位点;而28/63毒株新出现了264位点处的潜在N-糖基化位点。本研究提示目前中国大陆地区商业鸡群流行的H9N2亚型禽流感病毒NA基因分为2个差异较大分支——Y280-like分支和G9-like分支,而Y280-like分支仍是我国H9N2亚型禽流感病毒流行的主要类型。     

实时荧光PCR方法检测禽病毒病的研究

通用探针是实时荧光PCR探针类的一种,具有高度的特异性和灵敏度,可对样品进行准确的定量分析。本试验主要采用该方法对通用探针检测禽病毒病进行了研究,试验结果显示本方法的特异性、灵敏度和Taq Man探针相近,且具有操作简便、费用低廉等优点。     

鸡胚源大肠杆菌的分离鉴定及其致病性和耐药性分析

为了解鸡胚来源大肠杆菌的致病性和耐药性情况，本试验对山东省某白羽肉鸡孵化场6个不同批次种蛋孵化后随机抽检的174枚啄壳未出壳死胚的卵黄和胎粪进行了大肠杆菌分离。通过细菌培养、形态观察、生化试验方法鉴定大肠杆菌；通过小鼠攻毒试验和毒力基因PCR检测确定大肠杆菌分离株的致病性；利用纸片扩散法药敏试验检测大肠杆菌分离株的耐药性。结果显示，共分离鉴定大肠杆菌28株；小鼠攻毒试验结果显示，27大肠杆菌分离株对小鼠的致死率达到了50.0%以上，其中有24株超过了83.0%;在检测的14种毒力基因中，papA、papC、eaeA和vat四种基因未检出，fimC检出率最高(85.7%),另外9种毒力基因检出率介于3.6%～64.3%;菌株的致病性与携带的毒力基因数量大致呈正相关；耐药性检测结果显示，大肠杆菌分离株对10种抗菌药物具有不同程度的敏感性，耐药率介于17.9%～89.3%。结果表明，本试验分离的鸡胚源大肠杆菌绝大多数具有致病性，对临床常见抗菌药物存在不同程度的耐药。本试验结果为种鸡场加强大肠杆菌垂直传播的管理和控制以及临床用药的选择提供了参考依据。     

青岛地区3株犬细小病毒全基因组分析

为了探明青岛地区免疫过犬细小病毒(CPV)疫苗的犬因犬细小病毒感染死亡的原因，本研究采用全基因序列测定、系统进化树构建、基因分型和氨基酸分析的方法，对从临床发病犬中分离的3株CPV进行分析。结果显示，本实验室于2012年和2015年分离到的2株病毒(CPV-QD12和CPV-QD15)为new CPV-2a型，本研究分离到的1株病毒(CPV-QD20)为CPV-2c型；3株CPV在VP2的第5、267、297、324、370、426、440位氨基酸，NS1的第60、544、545、572、624、630位氨基酸发生了非同义替代。目前广泛使用的进口CPV弱毒活疫苗的基因型为原始的CPV-2型，与CPV流行毒株的基因型存在差异，这可能是造成CPV临床免疫失败的重要原因。因此，为了提升CPV疫苗的保护效率，建议使用CPV流行毒株研发CPV疫苗。     

研究生兽医高级病理学课程思政教学探索

依托专业课程进行思想政治的教育实践活动，实现全程育人、全方位育人、全员育人，是新时代高等教育教学改革的重要课题。本文就研究生兽医高级病理学课程的性质和内容，探讨融入思政教育的必要性。通过多点切入，融思政元素于兽医高级病理学教学内容，通过提高教师自身素质和合理应用教学方法，实现思政的教育和引领作用，探索兽医高级病理学课程思政教学的方法。     

鸡星状病毒、禽肾炎病毒和鸡传染性支气管炎病毒多重PCR检测方法的建立

为有效确定引起鸡痛风的病原，本试验建立了同时检测鸡星状病毒(CAstV)、禽肾炎病毒(ANV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的多重PCR方法。针对IBV的N基因、CAstV和ANV的ORF-1b基因分别设计了3对特异性引物，通过优化退火温度等反应条件建立了多重PCR检测方法，并评估了该方法的特异性和敏感性，而后对临床痛风样本进行了检测。结果显示，多重PCR方法对3种病毒扩增产物的大小分别为1 600 bp(IBV)、794 bp(ANV)和350 bp(CAstV);该多重PCR检测禽马立克氏病毒、血清4型禽腺病毒、减蛋综合征病毒和J亚型禽白血病病毒均为阴性；病毒最低检测限IBV为1.96×10~2 copies/μL,ANV为2.10×10~2 copies/μL,CAstV为1.33×10~5copies/μL;多重PCR对临床病料的检测结果与单项PCR的检测结果一致。结果表明，本试验建立的多重PCR检测方法具有较好的特异性、敏感性和可靠性，为临床鸡痛风的诊断提供了准确、有效的技术手段。